Microorganismos con uso potencial contra el nematodo de ovinos Haemonchus contortus

Abstract

La presente investigación tuvo como objetivo general evaluar la actividad antagónica de microorganismos con uso potencial contra el parásito de ovinos Haemonchus contortus. Esta investigación constó de cuatro estudios. En el primer estudio se obtuvo e identificó morfológica y molecularmente el aislamiento de una bacteria a partir de nematodos fitopatógenos. Los resultados obtenidos del análisis molecular mostraron un 95% de similitud con la región 16S rRNA de la bacteria Comamonas aquatica. A pesar de que los iniciadores utilizados en el presente estudio fueron específicos para Pasteuria-like, los antecedentes de esta bacteria al parecer no tienen relación con ninguna actividad antagónica en contra de nematodos; y regularmente no produce esporas. Por lo que el hecho de que las esporas adheridas a la cutícula de los nematodos correspondan o no a C. aquatica queda sin aclarar. Los resultados son considerados como inconsistentes; por lo que estudios posteriores como por ejemplo clonación del cDNA de la bacteria Pasteuria-like y otras pruebas moleculares utilizando a la bacteria Pasteuria-like como control positivo; además de técnicas complementarias de microscopía electrónica de barrido y de transmisión deberán ser llevadas a cabo de manera complementaria para estar completamente seguros de la correcta identificación de este microorganismo.Por otra parte, se evaluó la actividad de adosamiento in vitro de esporas de la bacteria Pasteuria-like (P-l) en contra de diversos estadios de desarrollo de Haemonchus contortus; además de los nematodos Meloidogyne spp. (J2) y Rhabditis sp. Los resultados mostraron los siguientes porcentajes de adhesión: para huevos de H. contortus=0%; L1=12%; L2=20%; L3=4%, L4=40%; para Rhabditis sp.=4% y Meloidogyne spp.=28%. Por primera vez se reporta el hallazgo de la presencia de esporas bacterianas adosadas a la pared cuticular del tercer estadio de desarrollo H. contortus. En el segundo estudio, se evaluó la actividad del ácaro Lasioseius penicilliger en contra de H.contortus (L3), Rhabditis sp. y Panagrellus redivivus. Los resultados mostraron porcentajes de reducción de 79.5% para H. contortus, 64.3% para P. redivivus y 80.7% para Rhabditis sp. Este resultado podría tener una implicación potencial en el empleo de ácaros de esta especie en el control de nematodos parásitos de importancia pecuaria. Se reporta por primera vez la actividad depredadora del ácaro L. penicilliger en contra de un nematodo parásito de animales. En el tercer estudio se evaluó el efecto depredador in vitro del nematodo Butlerius sp. en contra de tres diferentes nematodos: Haemonchus contortus (L3), Panagrellus redivivus y Rhabditis sp. La interacción entre Butlerius y H. contortus; resultó en una reducción de 91.8% de la población del parásito; mientras que la población de Butlerius se incrementó 131.6 veces. Para el caso de la interacción entre Butlerius y P. redivivus; la población del nematodo de vida libre se redujo en 80.9%; mientras que el nematodo depredador se incrementó 268.3 veces. La reducción de Rhabditis por acción del nematodo depredador fue de 62.5%; mientras que, el nematodo Butlerius se incrementó 82.7 veces. El nematodo Butlerius sp. mostró ser un eficiente antagonista natural de larvas infectantes del nematodo H. contortus. En el cuarto estudio se evaluó el efecto de la suplementación de comprimidos multinutricionales conteniendo clamidosporas del hongo Duddingtonia flagrans en ovinos de la raza Santa Cruz sobre la población de larvas de H. contortus en heces y sobre la ganancia de peso. Los resultados mostraron una reducción en la población de larvas infectantes de H. contortus en cultivos fecales de los ovinos suplementados con los comprimidos multinutricionales (CM) en un rango de 42.1-84.3% durante 11 semanas que duró el experimento, excepto en el 3er y 4to muestreo. La ganancia de peso diaria fue muy similar en ambos grupos de ovinos; siendo 136 g para el grupo suplementados con alimento comercial para ovinos y 163 g para el grupo suplementado con CM conteniendo clamidosporas del hongo D. flagrans. Con respecto al parámetro de volumen celular aglomerado, el grupo suplementado con CM mostró valores ligeramente más bajos que el grupo con alimento comercial para ovinos; sin embargo, la ganancia de peso no se vio afectada. El parámetro de condición corporal fue muy similar en ambos grupos. Respecto a la viabilidad de las clamidosporas de D. flagrans in vitro después de su paso a través del tracto digestivo de los ovinos, se observó en las placas de agar adicionadas con heces de los animales la formación y presencia de redes tridimensionales del hongo mostrando la presencia de nematodos atrapados. En esta investigación se concluye que los microorganismos evaluados actúan como antagonistas de H. contortus y podrían ser utilizados en futuros estudios para determinar su potencial antagónico en contra de la hemoncosis y de otras enfermedades causadas por nematodos de importancia en la industria ovina. _______________ ABSTRACT: This research was aimed to evaluate the antagonistic activity of microorganisms with potential use against the sheep parasitic nematode Haemonchus contortus. The work was divided into four studies. In the first one, the isolation of a bacterium attached to phytopathogenic nematodes followed by its morphological and molecular identification was achieved. Results of the molecular analysis showed 95% alignment with the 16S rRNA region of the bacterium Comamonas aquatica. Although, the primers used in the present study were specific for Pasteuria-like bacteria, the background of this bacterium seems to have no relationship to any antagonistic activity against nematodes also; and no spores are regularly produced by this microorganism. So, it was unclear wether the spores attached to the nematode cuticle corresponded or not to C. aquatica. Such results are considered inconclusive and further studies ie., cDNA cloning of the bacterium and molecular assays using DNA of Pasteuria-like as a positive control and also the use of scanning and transmission electronic microscopy complementary techniques should be performed to be completely sure about the identification of this microorganism. However, the in vitro Pasteuria-like (P-l) spore attachment was also evaluated against various developmental stages of Haemonchus contortus, Meloidogyne spp. (J2) and Rhabditis sp. The results showed the following attachment percentages: H. contortus eggs=0%; L1= 12%; L2=20%; L3=4%, L4=40%; for Rhabditis sp. =4% and for Meloidogyne spp. =28%. For the first time, the presence of spores of a bacterium attached to the cuticle of the third larval stage of H. contortus has been recorded. In the second study, the predatory activity of the mite Lasioseius penicilliger against H. contortus (L3), Rhabditis sp. and Panagrellus redivivus, was evaluated. The results showed the following reduction percentages: 79.5% for H. contortus, 64.3% for P. redivivus and 80.7% for Rhabditis sp. This is the first record of the predatory activity of the mite L. penicilliger against a parasitic nematode of sheep.This result has potential for exploitation of the use of mites of this species for the control of parasitic nematodes affecting sheep. In the third study, the in vitro predatory activity of the nematode Butlerius sp. against three different nematodes: Haemonchus contortus (L3), Panagrellus redivivus and Rhabditis sp. was evaluated. The interaction between Butlerius sp. and H. contortus resulted in 91.8% reduction in the population of the parasite; meanwhile, the Butlerius sp. population increased by 131.6-folds. Regarding the interaction between Butlerius sp.and P. redivivus, the population of the free-living nematode was reduced to 80.9%; meanwhile the population of the predatory nematode was increased 268.3-folds. On the other hand, the Rhabditis sp. population was decreased to 62.5% and Butlerius sp. population increased 82.7-folds. Butlerius sp. proved to be an efficient natural antagonist of H. contortus infective larvae. In the fourth study, the effect of supplying multinutritional pellets (MP) containing Duddingtonia flagrans chlamydospores on the reduction of the population of the parasitic nematode Haemonchus contortus in feces of St. Croix sheep, and on the daily weight gaining, was evaluated. The results showed a significant reduction of the infective stages of the parasite in fecal cultures of MP-supplied sheep ranging from 42.1-84.3% during the whole experiment, with exception of the third and fourth sampling. Daily weight gain was very similar in both MP-supplied (136 g) and MP-non-supplied (164 g) groups of sheep. The cell blood package values in the MP-supplied group were slightly lower than values in the control group supplied with sheep commercial food. However, daily weight gain was not affected. Likewise, body condition parameter in the two groups of sheep was very similar. Regarding the in vitro viability of D. flagrans spores after passing through the digestive tract of the sheep, the presence of tri-dimensional traps and trapped nematodes on agar plates added with the animal feces were observed. The results obtained in the present research work lead to the conclusion that the assessed microorganisms act as efficient natural antagonists of H. contortus infective larvae and that they could be used in further works to determine their antagonistic potential against sheep haemonchosis and other diseases caused by nematodes of importance in the sheep industry.