Determinación de la actividad enzimática extracelular de endo-1,3(4)-β-glucanasa y amplificación de genes endo-1,3(4)-β-glucanasa a partir de Moniliophthora roreri

Abstract

Se estudio la cinética de fermentación del hongo fitopatógeno Moniliophthora roreri en un sistema de fermentación en estado solido (FES) utilizando bagazo de caña de azúcar (BCA) como sustrato inductor. Los tratamientos (T) evaluados fueron: T1 bagazo de caña con inóculo de M. roreri; T2: Bagazo de caña sin inóculo. Se evaluó la actividad enzimática endo 1, 3(4)-β-glucanasa, pH y biomasa durante un período de 30 días. El hongo fitopatógeno M. roreri se identificó mediante la prueba de PCR y secuenciación del gen 18S ADNr, así como la región ITS1-5.8S-ITS2. Se diseñaron oligonucleótidos iniciadores para amplificar el gen codificante de la enzima, endo 1, 3(4)-β-glucanasa, a partir de secuencias de genes codificantes de esta enzima reportadas en otros hongos fitopatógenos.La actividad enzimática endo 1, 3(4)-β-glucanasa más alta se encontró el día 28 con 258.57 mU/mg de proteína total y con un pH de 7.22, lo que demostró ser el pH óptimo. Se obtuvo un fragmento de 1768 (pb) de la amplificación de la secuencia del gen 18S ADNr y se registró con el número de acceso JF730693 en GenBank (NCBI, E.U.A.). El fragmento amplificado presentó 99% de identidad máxima con respecto a la secuencia AY916745 depositada en GenBank correspondiente a M. roreri. La amplificación de la región ITS1-5.8S-ITS2 generó un fragmento de 758 pb y se registró con el número de acceso JF769489 en el GenBank, presentando 100% de identidad máxima con respecto a la secuencia GU457437 depositada en el GenBank. Se obtuvo un fragmento de 747 pb del gen (MrGLU1) que codifica la enzima endo 1, 3(4)-β-glucanasa y se registró con el número de acceso JN029800 en el GenBank. Dicho fragmento fue traducido a la secuencia de proteína, obteniéndose un fragmento de proteína (mrGLU1) de 249 aminoácidos, que presentó una identidad máxima de 87% con respecto a la secuencia de aminoácidos con número de acceso XP002389355 de endo-1,3(4)-β-glucanasa putativa de M. perniciosa, depositada en el GenBank. _______________ DETERMINATION EXTRACELLULAR ACTIVITY ENZYMATIC OF ENDO-1, 3(4)-β-GLUCANASE AND GENE AMPLIFICATION ENDO-1, 3(4)-β-GLUCANASE FROM MONILIOPHTHORA RORERI. ABSTRACT: Was study the fermentation kinetics of the phytopathogenic fungus Moniliophthora roreri in a solid state fermentation (SSF) using sugarcane bagasse (BCA) as a substrate inducer.Treatments (T) were evaluated: T1bagasse inoculums of M.roreri; T2: uninoculated cane bagasse. Enzymatic activity was evaluated endo1, 3 (4)-β-glucanase, pH and biomass over a period of 30 days. The phytopathogenic fungus M. roreri test was identified by PCR and 18S rDNA gene sequencing and the ITS1-5.8S region, ITS2. Oligonucleotide primers were designed to amplify the gene encoding the enzyme, endo 1, 3 (4)-β-glucanase, from sequences of genes encoding this enzyme reported in other fungal pathogens. The enzyme activity endo 1, 3 (4)-β-glucanase was found highest with 258.57 on 28 mU / mg of total protein and a pH of 7.22, which proved to be the optimum pH. We obtained a fragment of 1768 base pairs (bp) amplification of the sequence of 18S rDNA gene and registered with the access number JF730693 in GenBank (NCBI, USA). The amplified fragment showed 99% identity with maximum respect to the sequence deposited in GenBank AY916745 for M. roreri. Amplification of the ITS1-5.8S region, ITS2 generated a fragment of 758 bp and was registered under the accession number in GenBank JF769489, presenting maximum 100% identity with respect to the sequence deposited in GenBank GU457437. On the other hand obtained a fragment of 747 bp of the gene (MrGLU1) encoding the enzyme endo 1, 3 (4)-β-glucanase and registered under the accession number in GenBank JN029800. This fragment was translated into protein, obtaining a protein fragment (mrGLU1) of 249 aminoacids, which presented a maximum of 87% identity with respect to the amino acid sequence with access number XP002389355 endo-1, 3(4)-β-glucanase putative M. perniciosa, deposited in GenBank.