Purificación y caracterización bioquímica de la carboxipeptidasa (tcCP) de la semilla de cacao (Theobroma cacao L)

Abstract

La carboxipeptidasa tcCP de semillas de Theobroma cacao L., fue purificada 11.5 veces con un redimiendo de 45.5% con tres pasos de purificación que incluyen: homogenización y extracción de la fuente de enzima, precipitación con sulfato de amonio al 40% de saturación y cromatografía de intercambio iónico. El peso molecular de la enzima se estimo por electroforesis en gel de poliacrilamida al 12%, en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE), con tinción con plata. La tcCP es un monómero con peso molecular de 30.77 kDa, el cual hidroliza péptidos a temperatura de 40-50ºC y pH 7.0. El sustrato Bz-Tyr-pNA fue hidrolizado a una mayor proporción a 10 mM (13.576 UAE/mg de proteína total) confirmando la presencia de actividad carboxipeptidasa (CP) (E.C. 3.4.16). En relación a los substratos Leucina-p-nitroanilida (Leu-pNA) y Lisina-p-nitroanilida (Lys-pNA) para detectar actividad de aminopeptidasa, Alanina-prolina-p-nitroanilida (Ala-pro-pNA) para detectar la actividad Xaa-Pro-DAP, en ambas concentraciones 1 y 10 mM, no se detectó actividad de las enzimas mencionadas con ninguno de los substratos ensayados. El sitio activo contiene una serina debido a que la actividad enzimática de la tcCP fue reducida 89.47 % por fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF). Lo que indica que es una serina carboxipeptidasa. Sin embargo, la actividad de la tcCP es reducida por iones de mercurio, los que sugiere la presencia de un grupo sulfhidrilo adyacente al sitio activo de la enzima. El EDTA y 1,10-Fenantrolina inhibidores de metaloproteasas, no inactivaron la enzima. _______________ PURIFICATION AND BIOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF CARBOXYPEPTIDASE (tcCP) OF THE COCOA SEEDS (Theobroma cacao L.). ABSTRACT: Carboxypeptidase seeds tcCP from Theobroma cacao L., was purified 11.5 fold with a 45.5% redeeming with three steps procedure including: homogenization and extraction of the enzyme source, ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography. The molecular weight of the enzyme was estimated by polyacrylamide gel electrophoresis on 12% denaturing conditions (SDS-PAGE) with silver staining. The tcCP is a monomer with molecular weight of 30.77 kDa, which hydrolyzes peptides at temperature of 40-50 ° C and pH 7.0. The substrate Bz-Tyr-pNA was hydrolyzed to a greater share to 10 mM (13 576 UAE / mg of protein total) confirming the presence of carboxypeptidase activity (CP) (EC 4.3.16). In relation to the substrate leucine-p-nitroanilide (Leu-pNA) and Lys-p-nitroanilide (Lys-pNA) to detect aminopeptidase activity, alanine-proline-p-nitroanilide (Ala-Pro-pNA) to detect the activity Xaa-Pro-DAP, in both 1 and 10 mM concentrations, no activity was detected with the enzymes mentioned any of the substrates tested. The active site contains a serine because the enzymatic activity of the tcCP was reduced by 89.47% phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF). Morever, the activity of the tcCP is reduced by mercury ions, which suggests the presence of a sulfhydryl group adjacent to the active site of the enzyme. EDTA and 1,10-phenanthroline inhibitors of metallo-carboxypeptidases, did not inactivate the enzyme.