Establecimiento de un protocolo de extracción y purificación de RNA libre de RNA ribosomal (rRNA) de la microbiota ruminal para la generación de un meta-transcriptoma por RNA-seq.

Abstract

Los microorganismos ruminales se han estudiado principalmente con métodos de cuantificación microscópica o con la microscopia electrónica. Hoy en día las técnicas moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa, cuantitativa, digital y digital por gotitas (PCR, qPCR, dPRC, ddPCR respectivamente) han sustituido los métodos de identificación y caracterización de poblaciones microbianas complejas. Mediante la generación de meta-transcriptomas se puede conocer la actividad metabólica aún de microorgamismos incultivables. La generación de meta-transcriptomas requiere de RNA de alta calidad y, a la fecha, los meta-transcriptomas de muestras ruminales se realizan con RNA total; sin embargo, por la naturaleza misma de este ácido nucleico, el RNA ribosomal (rRNA) representa el mayor porcentaje del RNA total y solo una mínima parte corresponde a los trascritos. En consecuencia, se reduce la proporción de las secuencias relacionadas con la actividad transcripcional del meta-trasncriptoma con la secuenciación de fragmentos ajenos a mRNA. Este contexto presenta dos grandes desafíos, la estandarización del proceso de obtención de RNA y reducir al máximo el porcentaje de rRNA del RNA total. A pesar de que se ha logrado la eliminación rRNA de muestras complejas de diversos ambientes con kits comerciales, aún se desconoce si estos kits serían efectivos en una muestra de origen ruminal porque implica obtener trascritos de microorganismos eucarióticos y procarióticos simultáneamente. El objetivo de esta investigación fue establecer un protocolo de extracción y purificación de RNA libre de RNA ribosomal con la calidad suficiente para la generación de un metatranscriptoma de la microbiota del rumen. Se colectó líquido ruminal de cuatro borregos machos adultos de la raza Dorset de 80 ± 3 kg de peso vivo alimentados con dos tipos de dietas: alta en forraje (70%) y alta en concentrado (70%), utilizando un diseño experimental “Cross-over”, durante cuatro días, en dos horarios pospandrial diferentes cada uno. La extracción de RNA de las muestras de líquido ruminal se realizó de manera individual (una muestra por cada borrego y horario) y en “pool” (juntando las 8 muestras de cada hora por cada borrego). La lisis celular se realizó en un disruptor celular (Bead Bug, Benchmark Scientific) con 0.2 g perlas de vidrio (0.1 g de 0.1 mm y 0.5 mm de diámetro, respectivamente). La extracción de RNA se realizó con el reactivo TRIzol (Invitrogen) en las muestras individuales siguiendo el protocolo del fabricante; mientras que en las extracciones de los “pools” se realizó una segunda extracción con cloroformo. En el RNA total extraído se determinó la concentración e integridad mediante espectrofotometría y electroforesis en gel de agarosa al 1.2 %. En las muestras de RNA total íntegras se realizó un segundo “pool” correspondiente a las dietas concentrado (C) y forraje (F) obteniendo 2 en total. Estas se procesaron con el kit Ribo-Zero (RZ) de Illumina para la remoción del rRNA, basado en perlas magnéticas y sondas específicas para la selección del rRNA eucariótico y procariótico. Estas muestras libres de rRNA se purificaron y concentraron con el kit RNA Clean and Concentrator (Zymo Research) y después se cuantificaron por espectrometria. Al final se realizó la síntesis del DNA complementario (cDNA) con la enzima retrotrancriptasa (iScript Select, BIO-RAD), y se cuantificó el producto para determinar la cantidad total de producto obtenido. El protocolo propuesto en esta investigación para la extracion de RNA es eficiente, rápido y permite obtener RNA en cantidad y calidad suficiente para el proceso de purificación indistintamente a la procedencia de la muestra. La purificación del RNA total con el kit Ribo-Zero, redujo eficientemente el rRNA de las muestras y con base en el rendimiento final obtenido de RNA libre de rRNA, se deduce que el método es eficiente, el producto obtenido puede ser utilizado en la generación de un meta-transcriptoma y la síntesis de cDNA no se vio afectada por la reducción del rRNA. _______________ ESTABLISHMENT OF A PROTOCOL FOR RNA EXTRACTION AND PURIFICATION FREE FROM RIBOSOMAL RNA (rRNA) FROM THE RUMINAL MICROBIOTA FOR THE GENERATION OF A META-TRANSCRIPTOME BY RNA-seq. ABSTRACT: Ruminal microorganisms have been studied mainly by microscopic quantification methods or electron microscopy. Nowadays molecular techniques such as the Polymerase Chain Reaction (PCR), quantitative PCR (qPCR) and digital PCR (ddPCR) have replaced the methods of identification, quantification and characterization of complex microbial populations. Through the generation of meta-transcriptomes, the metabolic activity of uncultured microorganisms can be assessed. The generation of meta-transcriptomes requires high-quality RNA and, to date, most of the meta-transcriptomes derived from ruminal microbiota were performed with total RNA. Thus, due to the nature of this nucleic acid, ribosomal RNA (rRNA) represents most of the total RNA and therefore only a small part corresponds to transcribed regions. Consequently, the proportion of sequences related to the transcriptional activity of the meta-transcriptome is reduced with the sequencing of non-mRNA fragments. This context presents two major challenges, the standardization of the process of obtaining RNA and reducing to the maximum the percentage of rRNA of the total RNA. Although the rRNA elimination of complex samples from different environments has been achieved with commercial kits, it is still unknown if these kits would be effective in a sample of ruminal origin because it implies obtaining simultaneously transcripts both from eukaryotic and prokaryotic microorganisms. The objective of this research was to establish a protocol for extraction and purification of RNA free of ribosomal RNA with sufficient quality for the generation of a meta-transcriptome of the rumen microbiota. Ruminal fluid was collected from four adult male Dorset lambs of 80 ± 3 kg of live weight fed with two types of diets: high in forage (70%) and high in concentrate (70%), using an experimental design "Cross -over ", for four days, in two different postpandrial schedules for each animal. The extraction of RNA from the ruminal fluid samples was carried out individually (one sample per sheep and schedule) and in pools (8 samples were collected in the term of the 4 days of experiment for each lamb). Cell lysis was performed in a cellular disruptor (Bead Bug, Benchmark Scientific) with 0.2 g glass beads (0.1 g 0.1 mm and 0.5 mm diameter, respectively). RNA extraction was carried out with TRIzol (Invitrogen) following the manufacturer's protocol for the individual samples; whereas for the RNA extractions in pools, a second extraction with chloroform was carried out. In the total RNA extracted, the concentration and integrity were determined by spectrophotometry and electrophoresis in a 1.2% agarose gel. Once the quality of the RNA was assessed, the samples were pooled by the type of diet, thus resulting in 2 pols, one for the concentrate (C) and the other for forage (F). Both RNA were processed with the Ribo-Zero Epidemilogy kit (RZ) from Illumina for the removal of rRNA, which is based on magnetic beads and specific probes for the selection of eukaryotic and prokaryotic rRNA. These rRNA-free samples were purified and concentrated with the RNA Clean and Concentrator kit (Zymo Research) and then quantified by spectrometry. Finally, the synthesis of complementary DNA (cDNA) with the enzyme retrotrancriptase (iScript Select, BIO-RAD) was performed, and the product was quantified. The proposed protocol in this thesis for the extraction of RNA from ruminal microbiota is efficient and fast while obtaining RNA in sufficient quantity and quality regardless of the type of diet. The purification of the total RNA with the Ribo-Zero kit, efficiently reduced the rRNA of the samples as deduced from the yield obtained of RNA free of rRNA. This RNA could be used in the generation of a meta-transcriptome as the synthesis of cDNA was not affected by the reduction of rRNA.