Identificación, análisis, cuantificación y enfoque toxicológico de compuestos secundarios de Claviceps gigantea

Abstract

El hongo C. gigantea, parásita la inflorescencia femenina de maíz, produciendo esclerocios en lugar de semillas, se desarrolla en nichos con alta precipitación y bajas temperaturas. Los esclerocios producen alcaloides del tipo clavina. Existen antecedentes limitados del daño de estos compuestos en mamíferos, a pesar de haber zonas productoras del cultivo con incidencia del 90 %. Se planteó, determinar la distribución de C. gigantea en Valles Altos de México, diferenciar morfológica y molecularmente los aislados, determinar la concentración de alcaloides en esclerocios provenientes de esos diferentes sitios y determinar la actividad biológica de los compuestos presentes en esclerocios en gazapos. Por lo que, se realizaron recorridos de campo para la búsqueda de material sospechoso de C. gigantea. Con las muestras colectadas se elaboraron cultivos monospóricos de aislados asociados a Sphacelia sp. para analizar las características culturales de las colonias. De manera complementaria se amplificaron y secuenciaron fragmentos de las regiones Internal Transcribed Spacer (ITS) 1, 5.8S rRNA, NL4 y parte de la subunidad grande del ribosoma (LSU) y así caracterizar molecularmente las colonias. Con relación a la patogenicidad de los aislados se efectuaron pruebas de patogenicidad y se determinó el mejor método de inoculación. Se analizaron cualitativa y cuantitativamente los alcaloides presentes en los esclerocios por cromatografía en capa fina y cromatografía de líquidos de alta resolución respectivamente. La actividad biológica de los metabolitos se determinó en conejos machos, con dietas experimentales, donde se agregó polvo de esclerocios en sustitución de harina de alfalfa. Se evaluó peso vivo, consumo alimenticio y conversión alimenticia de cada conejo. Se tomaron muestras de sangre y finalmente, se les practicó la eutanasia. El hongo C. gigantea se encontró en zonas donde no estaba reportado como Hidalgo y Puebla. La cantidad de alcaloides encontrados en esclerocios es diferente en tiempo y espacio. El consumo de C. gigantea tiene efecto negativo, en relación con el peso corporal y consumo de alimento. Las necropsias revelaron anomalías proporcionales al consumo de alimento contaminado con esclerocios. _______________ IDENTIFICATION, ANALYSIS, QUANTIFICATION AND TOXICOLOGICAL APPROACH OF SECONDARY METABOLITES OF Claviceps gigantea. ABSTRACT: The fungus C. gigantea, parasitic female inflorescence of corn, producing sclerotia instead of seeds, develops in niches with high precipitation and low temperatures. Sclerotia produce clavine alkaloids. There is limited history of the damage of these compounds in mammals, despite the fact that there are areas producing the crop with an incidence of 90%. It was proposed to determine the distribution of C. gigantea in the High Valleys of Mexico, to differentiate morphologically and molecularly the isolates, to determine the concentration of alkaloids in sclerotia from these different sites and to determine the biological activity of the compounds present in sclerotia in rabbits. Therefore, field trips were conducted to search for suspect material of C. gigantea. With the collected samples, monosporic cultures of isolates associated with Sphacelia sp. to analyze the cultural characteristics of the colonies. In a complementary manner, fragments of the Internal Transcribed Spacer (ITS) 1, 5.8S rRNA, NL4 and part of the large subunit of the ribosome (LSU) regions were amplified and sequenced to characterize the colonies molecularly. In relation to the pathogenicity of the isolates, pathogenicity tests were carried out and the best method of inoculation was determined. The alkaloids present in the sclerotia were analyzed qualitatively and quantitatively by thin layer chromatography and high resolution liquid chromatography respectively. The biological activity of the metabolites was determined in male rabbits, with experimental diets, where sclerotium powder was substituted for alfalfa meal. Live weight, food consumption and feed conversion of each rabbit were evaluated. Blood samples were taken and finally, they were euthanized. The fungus C. gigantea was found in areas where it was not reported as Hidalgo and Puebla. The amount of alkaloids found in sclerotia is different in time and space. Consumption of C. gigantea has a negative effect, in relation to body weight and food consumption. The necropsies revealed anomalies proportional to the consumption of food contaminated with sclerotia.