Dinámica de la concentración bacteriana de Candidatus Liberiberibacter asiaticus y su efecto en la expresión sintomática e histológica en cítricos agrios y dulces e implicaciones en el potencial de inóculo.

Abstract

Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), bacteria causante del Huanglongbing (HLB), afecta diferencialmente a todas las especies de cítricos. En México, esta enfermedad se presenta en dos vertientes geográficas del país, siendo más prevalente en el Pacífico infectando limón mexicano (Citrus aurantifolia). La expresión de síntomas y las alteraciones histológicas inducidas por CLas son dependientes de la especie citrícola; sin embargo, existe un conocimiento limitado del efecto que tiene la bacteria en la expresión de síntomas en plantas de limón mexicano (Lm), persa (C. latifolia) (Lp) y naranja dulce (C. sinensis) (Nd) en función de la combinación injerto-portainjerto, por lo que el objetivo fue evaluar tres tipos de combinaciones injerto-portainjerto en la expresión de síntomas, la concentración bacteriana y su efecto a nivel histológico en plantas de cítricos agrios y dulces injertadas en tres patrones. Este trabajo se llevó a cabo en laboratorio e invernadero (INIFAP-C.E. Tecoman) y consistió de tres etapas. Etapa 1. Se comparó el efecto de la vareta procedente de la fuente de inóculo y la copa de cítricos agrios y dulces bajo el supuesto de un comportamiento diferencial de las combinaciones injerto-portainjerto en detrimento de los cítricos agrios. Tallos de 0.5cm de diámetro de limón mexicano infectado naturalmente y procedente de huertos comerciales de Colima se usaron como fuente de inóculo. La inoculación se realizó por injerto de aproximación en plantas de 1 año previamente establecidas en las combinaciones: Lm/C. macrophylla (Cm) 6 plantas, Lm/C. volkameriana (Cv) 6 plantas, Lp/Cm 6 plantas, Lp/Cv 6 plantas y Nd/Cv 6 plantas. Por planta se realizó la colecta de dos hojas, una de la sección proximal al punto de inoculación y de la sección distal, cada 30 días por 9 meses a partir de los 24 meses después de la inoculación (mdi). El análisis foliar se realizó de forma independiente. En cada fecha se registraron los síntomas visuales y se evaluó la severidad en el dosel mediante una escala de severidad de 5 clases (1=sano (0%), 2=síntomas leves (25%), 3=síntomas moderados (50%), 4=síntomas fuertes (75%) y 5=síntomas severos (100%)). Un total de 495 muestras se analizaron molecularmente mediante q-PCR con los iniciadores que amplifican para el gen 16S DNA ribosomal: HLBas (TCG AGC GCG TAT GCA ATA CG) y HLBp (GCG TTA TCC CGT AGA AAA AGG TAG), junto con la sonda HLBr (FAM-AGACGG GTGAGT AAC GCG/3BQH1). Histológicamente se analizaron 4,375 cortes basales de la nervadura central foliar. La concentración de CLas y anchura de floema se analizaron bajo un diseño de parcelas divididas (SAS® ver 9.4). Los tres cítricos presentaron variaciones en la expresión visual de los síntomas. Lm/Cm presentó fuerte clorosis y otros síntomas como punteado clorótico, moteado asimétrico, clorosis, aclaramiento de nervaduras. Fue la única combinación donde ocurrió muerte de ramas en tres de cinco plantas. Lm/Cv mostró exclusivamente una moderada clorosis. Los síntomas en Lp/Cm fueron análogos a Lm/Cm sin presentar muerte de ramas. Las plantas de Lp/Cv desarrollaron síntomas de punteado clorótico, aclaramiento de nervaduras y moteados asimétricos. En Nd/Cv los síntomas fueron de leves a moderados, y se presentó principalmente acorchado en hojas. A nivel de severidad en dosel, Lm/Cm fue el más afectado con un promedio del 75% a los 32 mdi. En los tres cítricos evaluados se presentó una tendencia similar en cuanto al incremento y decremento de la concentración de CLas en el tiempo, observándose dos picos importantes de máxima concentración; el primero a los 25 y 26 mdi y el segundo entre los 29 y 30 mdi. Las combinaciones de Lm/Cm y Lm/Cv presentaron las más altas concentraciones siendo estadísticamente diferentes (P=0.001) con respecto a los otros cítricos. Nd/Cv tuvo consistentemente la concentración más baja en un promedio del 57% y 28% con respecto a Lm/Cm y Lp/Cm, respectivamente. Histológicamente, en Lm/Cm la anchura de floema presentó el mayor incremento (93.5±2µm) respecto a la combinación de Nd/Cv (82.5±2µm) a los 32mdi, aunque no hubo diferencia estadística. En la Etapa 2 se seleccionó únicamente a Lm por presentar la mayor vulnerabilidad y se compararon los portainjertos Cm y Cv con naranjo agrio C. aurantium (Ca), bajo la hipótesis de su tolerancia a la infección de CLas y la restricción histológica para movilidad del inóculo a nivel de rama. El tipo y manejo del inóculo fue análogo a la Etapa 1. Las combinaciones probadas fueron: Lm/Cm 8 plantas, Lm/Cv 8 plantas y Lm/Ca 8 plantas, adicionalmente se comparó el efecto de sección basal y distal al sitio de inoculación seleccionando de cada planta tres ramas con dos secciones cada una. Se realizaron colectas a partir de los 12 mdi cada 30 días, por 9 meses. En cada fecha se registraron los síntomas visuales y se evaluó la severidad con la escala indicada previamente. Las muestras se analizaron molecularmente también mediante q-PCR (1161 muestras totales) e histológicamente (7,875 cortes analizados), bajo un diseño de parcelas divididas (SAS® ver 9.4). Los tipos de síntomas expresados en las distintas combinaciones fueron contrastantes y consistieron predominantemente en punteado clorótico, moteado asimétrico y clorosis leve en Lm/Cv; moteado albino (3/7 plantas) y aclaramiento de nervaduras en Lm/Ca; muerte de ramas (7/7) y muerte de plantas (5/7) en Lm/Cm. A nivel dosel, la mayor severidad se observó en Lm/Cm (60-100% dosel sintomático). En promedio la mayor concentración fue 1.1X106 copias CLas/µl en la combinación de Lm/Ca en cinco fechas (P=0.001). En general se detectó una tendencia inversamente proporcional a la expresión sintomática. Esta tendencia sobresalió en Lm/Cm. A mayor severidad (100%) menor concentración de CLas (Lm/Cm 4.2X105, 18 mdi) y a menor severidad (50%) mayores títulos bacterianos (Lm/Cm 2.0X104, 12 mdi). La combinación Lm/Ca se asoció con cierta tolerancia a CLas debido a que tuvo los títulos más altos de la bacteria (P=0.001) en cinco de nueve fechas pero una menor expresión de síntomas severos. A nivel histológico la anchura promedio del floema fue menor en Lm/Ca (74±2µm) con respecto a Lm/Cv 80±2µm y Lm/Cm 84±2µm, aunque no hubo diferencias estadísticas. En Lm/Ca el promedio de hiperplasia fue similar en las regiones proximal y distal de las ramas (76±2 µm), en contraste con las otras combinaciones de Lm/Cv y Lm/Cm donde el incremento de la hiperplasia fue mayor en la sección proximal (82±2 µm), lo que sugiere un efecto histológico restrictivo de movilidad del inóculo. Etapa 3. Se seleccionó naranja dulce por la detección de una condición asintomática en el centro de México y se evaluó Cv uno de los portainjertos menos vulnerable según etapas previas en comparación con el naranjo agrio (Ca), el portainjerto regional, incluyendo además la comparación del inóculo putativo asintomático (CLas-P) con dos sintomáticos procedentes de Jalisco (CLas-J) y Quintana Roo (CLas-Q). Este experimento consistió de 10 plantas por fuente de inóculo, los cuales se injertaron como la etapa 2, con las combinaciones Nd/Cv y Nd/Ca. A partir de los tres mdi se colectaron muestras cada 30 días por 5 meses. Secuencialmente, se seleccionaron hojas ascendentemente a partir de la base de una rama seleccionada por planta. En cada fecha se registraron los síntomas visuales y se evaluó la severidad en dosel. Las muestras se analizaron molecularmente mediante q-PCR (430 muestras totales) e histológicamente (1,350 cortes foliares analizados), bajo un diseño de parcelas divididas (SAS® ver 9.4). Los tipos de síntomas expresados en las distintas combinaciones fueron contrastantes y consistieron en aclaramiento de nervaduras y clorosis ligera en Nd/Ca, moteado difusos, moteado albino y clorosis en Nd/Cv. La expresión de síntomas inició entre los 101 y 135 ddi. La combinación Nd/Ca con CLas-P mantuvo su condición asintomática. La concentración bacteriana presentó fluctuaciones en las diferentes fechas de muestreo en un rango de 3.1x104 a 6.6X106. No se presentaron diferencias entre patrones con respecto al inóculo, pero si entre fuentes de inóculo, siendo mayor y estadísticamente diferente en CLas-J. Con este inóculo, la máxima concentración se detectó en Nd/Cv a los 122 ddi con 6.6X106. Se observó un efecto diferencial en la anchura del floema inducida por CLas según la fuente de inóculo con respecto al testigo sano. El efecto promedio fue de 38%, 28% y 27% para CLas-J, CLas-Q y CLas-P, respectivamente. La mayor alteración se observó en CLas-J (42±2 µm), lo que coincide con la alta concentración de CLas. La combinación Nd/Ca se asoció con cierta tolerancia a CLas debido a títulos altos de la bacteria (1.1X106 copias CLas/µl a los 4 mdi) con nula expresión de síntomas (CLas-P) o baja expresión de síntomas en CLas-J y CLas-Q (<25%). En general, las evidencias experimentales de este trabajo demuestran que existe un efecto del portainjerto en la expresión de síntomas, pero además una agresividad de CLas en términos histológicos y multiplicativos dependiendo de la fuente de inóculo, siendo CLas-J el más agresivo. La secuenciación molecular de muestras iníciales y finales del experimento 2 confirmó la invariabilidad de la fuente de inóculo provenientes de Colima (Número de accesión registrada en GenBank: KU159087 publicada el 10 mayo 2016). _______________ DYNAMICS OF BACTERIAL CONCENTRATION OF Candidatus Liberiberibacter asiaticus AND ITS EFFECT ON THE SYMPTOMATIC AND HISTOLOGICAL EXPRESSION IN SOUR AND SWEETS CITRUS FRUITS AND IMPLICATIONS IN THE INOCULUM POTENTIAL. ABSTRACT: Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), causing bacteria of Huanglongbing (HLB), differentially affects all citrus species. In Mexico, this disease occurs in two principle geographical regions, being more prevalent on the Pacific in Mexican lime (Citrus aurantifolia). The expression of symptoms and histological alterations induced by CLas depends on the citrus species; however, there is limited knowledge of the effect that the bacteria has in symptom expression in plants of Mexican lime (Lm), Persian (C. latifolia) (Lp) and sweet orange (C. sinensis) (Nd) based on graft-rootstock combination. In this sense, the aim of this research was to evaluate three types of graft-rootstock combinations about the expression of symptoms, bacterial concentration and its histological effect in grafted plants of sour and sweet orange in three patterns. This investigation was carried out in laboratory and greenhouse and consisted of three stages. Stage 1. The effect of vareta from the source of inoculum and the cup of sour citrus and sweet under the assumption of a differential behavior of graft-rootstock combinations detriment of sour citrus were compared. Stems of 0.5 cm diameter and naturally infected Mexican lime from commercial orchards of Colima were used as a source of inoculum. Inoculation was by approximation grafting 1 year old plants previously established in the combinations: Lm/C. macrophylla (Cm) 6 plants, Lm/C. volkameriana (Cv) 6 plants, Lp/Cm 6 pants, Lp/Cv 6 plants, Nd/Cv 6 plants. The was collected two leaves by plant from, one of the proximal section at the inoculation site and the second from the distal section. It was accomplished every 30 days for 9 months from 24 months after inoculation (mdi). Foliar analysis was performed independently. On each date, visual symptoms were recorded and severity in the canopy was assessed using a severity scale of 5 classes (1=healthy (0%), 2=mild symptoms (25%), 3=moderate symptoms (50%), 4=strong symptoms (75%) and 5=severe symptoms (100%)). A total of 495 samples were analyzed molecularly by q-PCR with primers that amplify for the 16S ribosomal DNA: HLBas (TCG AGC GCG TAT GCA ATA CG) and HLBp (GCG TTA TCC CGT AGA AAA AGG TAG), together with probe HLBr (FAM-AGACGG GTGAGT AAC GCG/3BQH1). 4,375 histologically basal cuts of the leaf midrib were analyzed. CLas concentration and phloem width were examined under a split plot design (SAS® see 9.4). The three citrus showed variations in the visual expression of symptoms. Lm/Cm presented strong chlorosis and other symptoms such as chlorotic stippling, asymmetric mottled, chlorosis, clearance ribs. This was the only combination where death of branches occurred in three of five plants. Lm/Cv showed only mild chlorosis. Symptoms in Lp/Cm were similar to Lm/Cm without presenting death of branches. Plants Lp/Cv developed symptoms of chlorotic stippling, ribs and asymmetrical clearance mottling. Nd/Cv symptoms were mild to moderate and befell mainly corked in leaves. A dossal severity level, Lm/Cm was the most affected with an average of 75% to 32 mdi. The three citrus especies evaluated showed a similar trend related to the increase and decrease of CLas concentration during time, observing two major peaks of maximum concentration; the first at 25 and 26 mdi and the second between 29 and 30 mdi. Combinations of Lm/Cm and Lm/Cv had the highest concentrations being statistically different (P=0.001) compared to other citrus fruits. Nd/Cv consistently had the lowest concentration by an average of 57% and 28% compare to Lm/Cm and Lp/Cm, respectively. Histologically, in Lm/Cm phloem width showed the highest increase (93.5±2µm) regarding the combination of Nd/Cv (82.5±2µm) to the 32mdi, although there was no statistical difference. In Stage 2, only Lm was selected for showing greater vulnerability. Cm and Cv rootstocks were compared with sour orange C. aurantium (Ca), under the hypothesis of tolerance to the infection of CLas and histological restriction for inoculum mobility at the branch level. The type and management of the inoculum was analogous to Stage 1. The combinations tested were: Lm/Cm 8 plants Lm/Cv 8 plants, Lm/Ca 8 plants, additionally the effect of basal and distal section compared to the site of inoculation selecting three branches of each plant with two sections each. Collections from 12 mdi every 30 days for 9 months were performed. On each date, visual symptoms were recorded and severity was assessed with the scale previously indicated. The samples were analyzed molecularly also by q-PCR (1161 total samples) and histologically (7,875 cuts analyzed), under a split plot design (SAS® see 9.4). The types of symptoms expressed in different combinations were contrasting and consisted predominantly in chlorotic stippling, asymmetric slight mottling and chlorosis in Lm/Cv; spotted albino (3/7 plants) and clearance ribs Lm/Ca; death of branches (7/7) and death of plants (5/7) in Lm/Cm. At dossal level, the greater severity was observed in Lm/Cm (60-100% symptomatic dossal). On average the highest concentration was 1.1X106 CLas copies/µl in the combination of Lm/Ca in five dates (P=0.001). In general, an inversely proportional tendency to the symptomatic expression was detected, stood at specially in Lm/Cm. As greater severity (100%) lower concentration CLas (Lm/Cm 4.2X105, 18 mdi) and as less severity (50%) higher bacterial titers (Lm/Cm 2.0X104 12 mdi). Lm/Ca combination was associated with a certain tolerance to CLas because it had the highest titers of bacteria (P=0.001) in five of nine dates but lower expression of severe symptoms. Histologically the average width of the phloem was lower in Lm/Ca (74±2µm) with respect to Lm/Cv 80±2µm and Lm/Cm 84±2µm, although there was no statistical difference. In Lm/Ca average hyperplasia was similar in the proximal and distal regions of the branches (76±2µm), in contrast to other combinations of Lm/Cv and Lm/Cm where increased hyperplasia was higher in the proximal section (82±2µm), suggesting a restrictive histological effect of the inoculum mobility. Stage 3. Sweet orange was selected because of the detection of an asymptomatic condition in central Mexico and Cv was evaluated as one of the least vulnerable rootstocks according to previous stages compared with the sour orange (Ca), the regional rootstock, including as well the comparison of asymptomatic putative inoculum (CLas-P) with two symptomatic from Jalisco (CLas-J) and Quintana Roo (CLas-Q). This experiment consisted of 10 plants per source of inoculum, which were grafted as in stage 2, with the combinations: Nd/Cv and Nd/Ca. From the three mdi samples they were collected every 30 days for 5 months. Sequentially, ascending leaves were selected from a selected the base branch per plant. On each date, visual symptoms were recorded and dossal severity was assessed. Samples were analyzed molecularly by q-PCR (430 total samples) and histologically (1,350 cuts analyzed), under a split plot design (SAS® see 9.4). The types of symptoms expressed in different combinations were contrasting and consisted in clearance ribs and slight chlorosis in Nd/Ca and diffuse mottled, mottled albino and chlorosis Nd/Cv. The expression of symptoms started between 101 and 135 ddi. The Nd/Ca combination with CLas-P maintained its asymptomatic condition. The bacterial concentration showed fluctuations at different sampling dates in a range of 3.1x104 to 6.6X106. No differences between patterns with respect to inoculum were presented, but between sources of inoculum, being higher and statistically different CLas-J. With this inoculums, maximum concentration was detected in Nd/Cv to 122ddi with 6.6X106. A differential effect on CLas width phloem induced by the inoculum source was observed, with respect to the healthy control. The average effect was 38%, 28% and 27% for CLas-J, CLas-Q and CLas-P, respectively. The major alteration was perceived in CLas-J (42±2 µm), which coincides with the high concentration of CLas. The Nd/Ca combination was associated with a certain tolerance CLas due to high titers of bacteria (1.1X106 copies CLas/ul at 4 mdi) with no expression of symptoms (CLas-P) or low expression of symptoms in CLas-J and CLas-Q (<25%). In general, the experimental evidence of this study evidence that there is an effect of the rootstock in the expression of symptoms, but also aggressiveness CLas in histological and multiplicative terms depending on the source of inoculum being CLas-J more aggressive. The molecular sequencing of initial and final samples of experiment 2 confirmed the invariance of the inoculum source from Colima (Accession number registered in GenBank: KU159087 published on May 10, 2016).