Producción de gases de efecto invernadero y fermentación ruminal in vitro de follajes tropicales: efecto de los metabolitos secundarios.

Abstract

El sector ganadero contribuye con aproximadamente el 14.5 % del total de gases de efecto invernadero, de los cuales el 44% son emisiones de CH4, el 29% de N2O y 27% de CO2. El CH4 entérico es generado por arqueobacterias en el rumen a través de la reducción del CO2 con H2, los cuales son producidos por bacterias, hongos y protozoarios durante sus procesos de fermentación. Se estima que un bovino adulto genera de 250 a 500 L de CH4 al día lo que representa una pérdida de 2 al 12% de la energía consumida. Al respecto, se han evaluado diversas estrategias para disminuir la producción de metano entérico en los rumiantes, siendo una de ellas el uso de árboles y arbustos forrajeros tropicales los cuales contienen metabolitos secundarios. Un aspecto a resaltar es que la mayoría de las investigaciones enfocadas en evaluar la capacidad antimetanogénica de diversos árboles y arbustos en la alimentación de rumiantes, no consideran los cambios en la microbiota ruminal, aspecto fundamental ya que los microorganismos del rumen son los responsables de proveer bióxido de carbono y H2 para la síntesis de metano entérico. Por lo anterior, el objetivo de esta investigación fue evaluar la producción de metano y bióxido de carbono en la fermentación ruminal in vitro de follajes tropicales y su correlación con el contenido de taninos condensados y saponinas. La tesis se divide en dos capítulos. En el capítulo I, se evaluaron in vitro follajes de Leucaena leucocephala, Moringa oleifera, Albizia lebbeck, Enterolobium ciclocarpum, Piscidia piscipula, Brosimum alicastrun, Lysiloma latisiliquum, Guazuma ulmifolia, Cnidoscolus aconitifolius, Gliricidia sepium y Bursera simaruba, así como de un pasto Cynodon plectostachyus. Los resultados obtenidos muestran que G.ulmifolia posee el contenido más elevado de TC y saponinas (7% y 6.6%, respectivamente), mientras que M.oleifera y C. plestostachius poseen el contenido más bajo de TC (0.02% y 0.34%, respectivamente). La mayor degradabilidad de la MS a las 72 horas se presentó con Brosimun alicastrum (69 %) y Cnidoscolus aconitifolius (61 %) (P<0.05). Los follajes que presentaron menos del 35% de degradabilidad fueron: Guazuma ulminifolia, Piscidia piscipula, Leucaena leucocephala, Enterolobium cyclocarpum, lysiloma latisulicuum. Por otro lado, Cnidoscolus aconitifolius, Moringa oleífera, Brosimun alicastrum y Albizia lebbeck, tuvieron mayor concentración de ácidos grasos volátiles (>75 mmol/L). La mayor producción de metano y bióxido de carbono la tuvo Cynodon plestostachius (>40 ml/g MS incubada para cada uno), mientras que Leucaena leucocephala, Enterolobium cyclocarpum y Lysiloma latilisicuum produjeron menos de 7 y 15 ml de metano y bióxido de carbono por g de MS incubada, respectivamente. Existe una correlación negativa con la cantidad de taninos condensados y la producción de metano (-0.44), no así entre el contenido de saponinas y la producción de metano (-0.06); sin embargo, sí existe una correlación entre el contenido de taninos condensados y degradabilidad de la materia seca (-0.59). En el capítulo II se evaluaron dos protocolos de extracción de DNA a partir de muestras de líquido ruminal con la finalidad de seleccionar un protocolo y emplearlo para la evaluación de los cambios en las poblaciones microbianas mediante PCR digital mediante los genes ribosomales e ITS. Se optimizó el protocolo de Yu-Morrison y éste se utilizó para probar los oligonucleótidos en una reacción de PCR de punto final. _______________ GREENHOUSE GASES PRODUCTION AND RUMINAL FERMENTATION IN VITRO TROPICAL FOLIAGES: EFFECT OF SECONDARY METABOLITES. ABSTRACT: Cattle production contributes around 14.5 % of the total Green House Gases emissions of which 44 % correspond to CH4, 29% to N2O and 27% to CO2. Enteric CH4 is produced by archae living in the rumen through the reduction of CO2 with H2 derived from fermentation byproduct from bacteria, fungi and protozoa. Cattle produces between 250 – 500 L of CH4 daily which represents a loss of 2- 12% of the consumed energy intake. Several strategies to diminish CH4 production in ruminants have been evaluated including the use as feed of tropical trees and shrubs fodder that contain diverse secondary metabolites. So far most of the research employing tropical shrubs and trees as fodder in ruminants to evaluate their antimethanogenic effects do not analyze the ruminal microbial population, which are responsible of the CO2 with H2 production that serve as the CH4 building blocks. Thus the present work objective was the evaluation of CH4 and CO2 production during ruminal fermentation of fodder from tropical shrubs and trees in an in vitro assay and correlate these gases production with the condensed tannin and saponin fodder content. This thesis is divided in two chapters. In chapter number I, fodder from Leucaena leucocephala, Moringa oleifera, Albizia lebbeck, Enterolobium ciclocarpum, Piscidia piscipula, Brosimum alicastrun, Lysiloma latisiliquum, Guazuma ulmifolia, Cnidoscolus aconitifolius, Gliricidia sepium y Bursera simaruba, as well as the grass Cynodon plectostachyus were evaluated an in vitro fermentation assay. Our results show that G.ulmifolia had the highest content of concentrated tannins and saponins (7% and 6.6%, respectively), whereas M.oleifera y C. plestostachius had the lowest content of concentrated tannins (0.02% and 0.34%, respectively). Dry matter degradability after 72 hours was higher with Brosimun alicastrum (69%) and Cnidoscolus aconitifolius (61%) (P<0.05). Fodder with less than 35% of degradability were Guazuma ulminifolia, Piscidia piscipula, Leucaena leucocephala, Enterolobium cyclocarpum, Lysiloma latisulicuum. The highest concentration of Volatile Fatty Acid were found in Cnidoscolus aconitifolius, Moringa oleífera, Brosimun alicastrum and Albizia lebbeck with more than 75 mmol/L. As expected Cynodon plestostachius had the highest amount of CH4 and CO2 production with more than 40 ml/g of dry matter from each one, whereas Leucaena leucocephala, Enterolobium cyclocarpum y Lysiloma latilisicuum produced less than 7 and 15 ml/g of CH4 and CO2 respectively. Our results showed a negative correlation between condensed tannins and methane production (-0.44), but not between saponin and methane production (-0.06). However condensed tannins and degradability showed a negative correlation (-0.59). In chapter II, two different DNA extractions protocols for ruminal samples were evaluate with the aim to select one and employ it to evaluate changes in the ruminal microbial populations by means of ribosomal and ITS markers with digital PCR. Yu-Morrison protocol was optimized and the obtained DNA was tested with oligonucleotides in a PCR.