Construcción de bibliotecas de cDNA para búsqueda de genes de resistencia a sequía en Bouteloua gracilis.

Abstract

El pasto navajita (Bouteloua gracilis) [Willd. ex Kunth] Lag. ex Griffiths es una planta altamente tolerante a la sequía, y por tanto una fuente potencial de genes relacionados con estrés hídrico. A la fecha se tienen los primeros esquemas biotecnológicos en este pasto, siendo el desarrollo de los primeros cultivos celulares clorofílicos de Bouteloua gracilis dentro de la familia Poaceae, un parteaguas para el estudio de los mecanismos que le permiten a esta gramínea tolerar las severas condiciones ambientales que prevalecen en su área de distribución. El presente estudio tuvo como finalidad evaluar algunos mecanismos fisiológicos y moleculares que ocurren en las células clorofílicas de B. gracilis cuando se encuentran en estrés osmótico inducido mediante polietilenglicol 8000 (PEG) al 14 y 21%. Para el estudio de los mecanismos celulares se cuantificaron los osmolitos prolina, glicina betaína (GB), sacarosa, fructuosa, glucosa, trehalosa y almidón, además de los niveles de clorofila, peso fresco y seco de las células, potencial osmótico, hídrico y de turgencia. Para la determinación de GB se realizó una modificación de una técnica espectrofotométrica para aplicarla en cultivos celulares con altos contenidos de GB. Posteriormente, se construyeron bibliotecas de cDNA a partir de células clorofílicas sometidas a estrés osmótico, con la finalidad de realizar una búsqueda de genes relacionados con la tolerancia al estrés hídrico. Con la modificación de la técnica para cuantificación de GB se logró obtener un método simple, rápido, confiable y barato para la determinación de este osmolito en muestras de plantas y cultivos celulares en suspensión. Los resultados obtenidos en las cinéticas de crecimiento mostraron que el tratamiento con 21% de PEG produjo los niveles máximos de osmolitos como prolina, GB, trehalosa, glucosa, fructuosa y también de clorofila. A partir de bibliotecas de cDNA provenientes de células clorofílicas del día 6 en tratamiento con PEG, se logró aislar 335 clonas putativas positivas, encontrándose en la clona 13, que fue hibridada con la sonda superóxido dismutasa (SOD), mostró una similitud del 98% con el gen que codifica para la proteína WOX5A que ha sido identificada en la diferenciación celular y el metabolismo secundario en Zea mays, 98% de similitud con acuaporinas PIP (HvPIP2) de Hordeum vulgare y 75% con IncRNA de respuesta a estrés hídrico en Zea mays. _______________ CONSTRUCTION OF cDNA LIBRARIES FOR SEARCHING GENES OF DROUGHT RESISTANCE IN Bouteloua gracilis. ABSTRACT: Grama grass (Bouteloua gracilis) [Willd. ex Kunth] Lag. ex Griffiths is a plant highly drought tolerant plant, and therefore, a potential source of genes related to water stress. To date, the first biotechnological schemes have been developed to this grass, with the development of the first chlorophyllic cell cultures of Bouteloua gracilis within the Poaceae family, as a breakthrough for the study of mechanisms that allow this grass tolerate the severe environmental conditions prevailing in its distribution area. This study aimed to evaluate some physiological and molecular mechanisms that occur in the chlorophyllic cells of B. gracilis under osmotic stress as induced by polyethylene glycol 8000 (PEG) 14 and 21%. For the study of cellular mechanisms osmolytes proline, glycine betaine (GB), sucrose, fructose, glucose, trehalose and starch were quantified, as well as chlorophyll levels, fresh and dry weight of cells, osmotic, water and pressure potentials. For determination of GB a modification of a spectrophotometric technique was performed for applying it in cell cultures with high contents of GB. Subsequently, cDNA libraries were constructed from chlorophyllic cells subjected to osmotic stress, in order to conduct a search of genes related to water stress tolerance. The modification of the technique for quantifying GB resulted in a simple, fast, reliable and inexpensive method to determine this osmolyte in plant samples and cell cultures in suspension. Results obtained from growth kinetics showed that treatment with 21% PEG produced the highest levels of such osmolytes as proline, GB, trehalose, glucose, fructose and chlorophyll. It was possible to isolate 335 positive putative clones through cDNA libraries from chlorophyllic cells at the sixth day under the PEG treatment. Clone 13, which was hybridized with the superoxide dismutase (SOD) probe, showed a similarity of 98% with the gene encoding WOX5A protein, identified in cell differentiation and secondary metabolism in Zea mays, 98% similarity with PIP aquaporins (HvPIP2) of Hordeum vulgare and 75% similarity with IncRNA related to water stress response in Zea mays.