Producción de taxoides en cultivos in vitro de callos y células elicitadas de Taxus globosa

Abstract

Los objetivos de este trabajo fueron: establecer un método de propagación in vitro para callos y células en suspensión de Taxus globosa, se realizaron pruebas de viabilidad celular; se elicitaron suspensiones celulares con jasmonato de metilo, etanol y una combinación de peróxido de hidrógeno con butionina de sulfoximina. Se cuantificaron tres taxoides: taxol, cefalomanina y 10-diacetil baccatina por Cromatografía Liquida de Alta Resolución en cultivos in vitro de callos, células elicitadas y hojas de T. globosa. La inducción de los callos se originó a los 40 días, el mayor porcentaje se obtuvo con el tratamiento de picloram y polivinil pirrolidona. El análisis por Cromatografía Líquida de hojas de un extracto crudo en metanol registró la mayor acumulación de taxoides totales, mientras que en el extracto crudo de callos con metanol se observó una alta concentración de 10-diacetil baccatina. Los cultivos crecidos en medios de cultivo B5 con 13.4 µM de ácido naftalenacético y 6.72 µM de picloram, presentaron el mejor crecimiento y una coloración verde cristalina. La prueba de diacetato de fluoresceína reveló que muchas de las células fluorescen, indicando que los cultivos celulares se mantienen viables a lo largo del tiempo. Se observó el efecto de las hormonas a nivel microscópico sobre las células, en el medio de cultivo adicionado con ácido naftalenacético las células se mostraron alargadas y formando agregados, con ácido naftalenacético y bencil-aminopurina las células mostraron proliferación; con ácido naftalenacético y picloram, las células mostraron una elongación y separación celular. La máxima ganancia en peso seco se observó con los tratamientos de BSO y H2O2 en el octavo día después de la siembra. Con jasmonato de metilo se presentó el menor crecimiento en el octavo día. El pH de los cultivos celulares osciló en un rango de 5.2 a 6.2. Respecto al volumen de medio consumido, éste fue ascendente. En los experimentos de elicitación los resultados fueron: la mayor acumulación de taxoides se obtuvo en el tratamiento con peróxido de hidrógeno más butionina de sulfoximina, aumentando 81 % la producción de 10-diacetil baccatina en el sexto día, 2 % la cefalomanina en el octavo día y con una detección menor a 1% de taxol en el décimo día respecto al control. _______________ TAXOIDS PRODUCTION IN CROP OF CALLOS in vitro AND ELICITED CELLS OF Taxus globosa. ABSTRACT: The objectives of this study were: to establish a method of propagation in vitro in callus and cells, to perform HPTLC assays in callus, cell viability testing, to elicit cell suspensions with methyl jasmonate, ethanol and a combination of hydrogen peroxide with buthionine sulfoximine. Three taxoids were quantified: taxol, cephalomannine and 10-diacetyl baccatin using High Resolution Liquid Chromatography in callus in vitro cultures, elicited cells and leaves of T. globosa. The callus induction of T. globosa was originated after 40 days, the highest percentage was obtained with treatment of picloram and polyvinyl pyrrolidone. Liquid Chromatography analysis showed the greatest accumulation of taxoids in sheets from crude extract with methanol. HPLC analysis of the crude extract of callus with methanol had a high concentration of 10-diacetyl baccatin. FDA testing revealed that many of the cells fluoresced, indicating that the cell cultures remain viable throughout the time. It was observed that the effect of hormones on a microscopic level on cells in culture medium supplemented with naphthalene acetic acid the cells were long and forming groups. On treatment naphthalene acetic acid/benzyl-aminopurine showed cell proliferation; on treatment with the phytohormones naphthalene acetic acid/picloram showed cell elongation and cell separation. The maximum dry weight gain was observed with treatments of hydrogen peroxide plus buthionine sulfoximine on the eighth day after sowing. With methyl jasmonate elicitor, a slower growth was shown on the eighth day. pH units of the crops ranged from 5.2 to 6.2. In relation to the volume of spent medium, this consumption was ascending. In the experiments of elicitation the results were: accumulation of taxoids as obtained in the treatment with hydrogen peroxide plus buthionine sulfoximine, increasing 81% of the production of 10-diacetyl baccatin on the sixth day, 2% cephalomannine in the eighth day and with the lower detection of taxol in the tenth day related to control.