Progagación in vitro de Mammillaria coahuilensis var coahuilensis (Boedeker) Moran y Echinocactus platyacanthus Link & Otto a partir de semilla para su conservación

Abstract

Se conoce relativamente poco de la propagación de las cactáceas in vitro. Generalmente se utiliza la semilla, tejido vascular y la activación de las areolas. Sin embargo, son pocas las especies que se multiplican y se preservan por estos medios de propagación. Mammillaria coahuilensis var. coahuilensis (Boedeker) Moran es endémica de Coahuila, Méx. y ha sido sobre recolectada por su valor como planta de ornato y Echinocactus platyacanthus Link & Otto se distribuye del centro al norte del país, a pesar de su amplia presencia, es una especie sobre explotada, principalmente para la elaboración de dulce (acitrón) y como alimento para el ganado. Por esta actividad humana ha sido difícil conseguir planta y al igual que la semilla y por lo tanto se reduce la probabilidad de propagar e incrementar su población. Por lo anterior, M. coahuilensis var. coahuilensis se encuentra considerada como planta amenazada y E. platyacanthus está sujeta a protección especial, de acuerdo a la norma NOM-059-2001 para México y se encuentran reportadas en la lista internacional de CITES, en el apéndice II, por lo que se requiere de otros métodos que asegure la preservación. El objetivo general del presente trabajo fue establecer la propagación in vitro de M. coahuilensis var. coahuilensis y E. platyacanthus a través del uso, como inoculo, de semillas. Se utilizaron las semillas por ser fácil su manejo y producir individuos libres de patógenos. Como hipótesis fundamental se planteó que la aplicación de auxinas y citocininas en las plántulas obtenidas a partir de semilla de M. coahuilensis var. coahuilensis y E. platyacanthus inducirían la formación de brotes. Para esta investigación se utilizó el medio de cultivo de Murashige and Skoog (MS) (1962) suplementado con glicina (2.0 mg L-1), mio-inositol (100.0 mg L-1), tiamina HCl (0.4 mg L-1), piridoxina HCl (0.5 mg L-1), ácido nicotínico (2.0 mg L-1). A esta composición en lo sucesivo le llamaremos medio MS. El pH fue de 5.7-5.8, ajustando con 0.1 de hidróxido de sodio o 0.1 de ácido clorhídrico. Los frascos con 25 ml de medio con tapas de plástico fueron esterilizados en autoclave a 121 °C durante 20 min. Lo anterior se aplicó en las pruebas para las dos especies. Para M. coahuilensis var. coahuilensis que presenta semillas pequeñas con germinación epigea y además son ortodoxas, se utilizaron semillas con 42 meses de edad, las cuales se dividieron en dos lotes. En el primer lote se utilizaron para la primera siembra 150 semillas las cuales se esterilizaron con el procedimiento siguiente: agua jabonosa por 5 min; enjuagándose con agua corriente; en seguida se sumergieron en etanol al 70 % por 1 min y posteriormente en hipoclorito de sodio al 1.2 % por 10 min. Finalmente se enjuagaron tres veces en agua desionizada esterilizada. Con el segundo lote se realizó la segunda siembra con 290 semillas que se esterilizaron con el procedimiento siguiente: agua jabonosa por 15 min y luego etanol al 70 % por 1 min. Posteriormente se introdujeron en hipoclorito de sodio al 1.2 % por 15 min y se lavaron tres veces en agua destilada esterilizada. Se sembraron 10 semillas por frasco, las cuales se colocaron en medio MS con el 25 % de macronutrimentos y 30 g L-1 de sacarosa. La inducción de brotes se realizó en dos fases. En la primera fase se emplearon 100 plántulas obtenidas de semillas germinadas in vitro colocándose en medio MS con el 100 % de macronutrimentos y 30 g L-1 sacarosa. Los tratamientos fueron los reguladores de crecimiento 6-(у, у-dimetilalilamino) purina (2iP), tidiazurón (TDZ) y ácido naftalenacético (ANA) combinadas de la forma siguiente: solas 2iP, TDZ, y ANA:2iP y ANA:TDZ, variando las concentraciones entre ellas. En la segunda fase se utilizaron los callos obtenidos de la fase anterior sembrados en el mismo medio utilizando otras concentraciones de los reguladores de crecimiento. Las variables evaluadas fueron: germinación (%), el índice de velocidad de germinación (semillas/día) (IVG), tipo y color de callo, número de brotes, brotes que formaron raíces (%) y aclimatación (%). Con respecto a E. platyacanthus, cuyas semillas que son consideradas medianas y tienen una germinación epigea y ortodoxa, se realizó una prueba de viabilidad con cloruro de tetrazolio al 0.1 % en 10 semillas de un lote de 50 semillas de las 200 que se tenían. La edad de estas semillas era de 10 meses. Se evaluó la viabilidad y posteriormente se determinó su porcentaje de germinación al igual que la velocidad. La esterilización de la semilla consistió en lavar la semilla en una solución jabonosa en agua corriente por 20 min y se enjuagó; posteriormente se sumergió en alcohol al 70 % por 1 min, se pasaron a hipoclorito de sodio al 1.2 % por 15 min y finalmente se realizaron tres enjuagues de agua destilada estéril. Se sembraron 10 semillas por frasco, utilizando el medio MS con el 100 % de macronutrimentos y 30 g L-1 sacarosa. Se utilizaron 56 plántulas obtenidas de la semilla germinada de E. platyacanthus las cuales se utilizaron para la inducción de brotes. Se sembraron en medio MS al 100 % y 30 g L-1 sacarosa. Los tratamientos fueron los reguladores de crecimiento 6-(у, у-dimetilalilamino) purina (2iP), tidiazurón (TDZ) y ácido naftalenacético (ANA) combinadas de la forma siguiente: solas 2iP, TDZ, y ANA:2iP, ANA:TDZ. Se realizaron dos fases. En la primera fase se utilizó el medio de cultivo anterior variando la concentración de las citocininas, y en la segunda fase, además de variar la concentración de los reguladores se suplementó con glutamina (250 mg L-1) y arginina (40 mg L-1). Las variables evaluadas fueron: germinación (%), el índice de velocidad de germinación (semillas/día) (IVG), viabilidad, tipo y color de callo, número de brotes y brotes que formaron raíces (%). En el establecimiento de la presente investigación se espera que con los tratamientos antes mencionados se alcance la propagación in vitro de las especies M. coahuilensis var. coahuilensis (en Coahuila) y E. platyacanthus (desde Puebla hasta Coahuila) y de esta manera contribuir a su rescate donde se desarrollan en forma natural. Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con diez (M. coahuilensis var. coahuilensis) y cinco (E. platyacanthus) repeticiones, el análisis de datos se realizó usando el análisis de varianza (ANOVA) con SAS y la prueba de medias fue con la prueba de Tukey (alpha=0.05). Los resultados obtenidos arrojaron que para M. coahuilensis var. coahuilensis el porcentaje de germinación fue de 25.5 % para la primera siembra y en la segunda de 26.4 %. La germinación promedio fue de 26.0 %. El IVG para la primera siembra de 1.6 semillas/día y en la segunda siembra de 3.6 semillas/día. El tipo de callo más común fue el compacto. El color de callo más común fue el verde y el rojizo que se presentó solamente en los medios con TDZ al 2.5 mg L-1. Esta coloración es posible se deba a la presencia de betalainas. La vitrificación fue observada en los brotes cultivados con TDZ. El mayor número de brotes se presentó en el medio con 2.0 mg L-1 de 2iP (0.9 brotes/explante en promedio); aparentemente el empleo de 2iP favorece la formación de brotes lo que concuerda con la respuesta obtenida con otras mamilarias. El enraizamiento fue del 56.5 % en un medio MS al 100 % de las sales inorgánicas. La generación espontánea de raíces es un proceso normal en las cactáceas. Se obtuvo el 92.3 % de plantas aclimatadas. En E. platyacanthus se obtuvo una viabilidad baja de semillas, además de presentar una coloración rosa pálida los embriones, mientras que el porcentaje de germinación fue de 32.9 % con una velocidad de 1.0 semillas/día. Con respecto a la viabilidad las semillas no tomaron la coloración rosa intenso que se esperaba como sucede con las pruebas con semillas ortodoxas comunes además de que la misma prueba requirió de varios días. El tipo de callo más común fue el compacto. El color de callo el verde. El mayor número de brotes se presentó en el medio con 0.2 mg L-1 de ANA y 3.0 mg L-1 de 2iP (1.6 brotes/explante en promedio); aparentemente el empleo de 2iP favorece la formación de brotes lo que concuerda con la respuesta obtenida con otras especies. El enraizamiento fue del 100 % en un medio MS al 100 % de las sales inorgánicas._______________ ABSTRACT: It is known the propagation of cactus the test-tube ones relatively little. It is generally used the seed, vascular tissue and the activation of the areolas. Nevertheless, the species are few that multiply and they are preserved by these means of propagation. Mammillaria coahuilensis var. coahuilensis (Boedeker) Dwell is endemic of Coahuila, Méx. and on it has been collected by his ornamental value and Echinocactus platyacanthus Link & Otto is distributed of the center to the north of the country, in spite of its ample presence, is an operated species on, mainly for the elaboration of candy (acitrón) and like food for the cattle. By this human activity it has been difficult to secure plant and like the seed and therefore is reduced the probability of propagating and of increasing its population. By the previous thing, M. coahuilensis var. coahuilensis is considered as it plants threatened and E. platyacanthus is subject to special protection, according to norm NOM-059-2001 for Mexico and they are reported in the international list of CITES, in appendix II, reason why it is required of other methods that the preservation assures. The general objective of the present work was to establish the test-tube propagation of M. coahuilensis var. coahuilensis and E. platyacanthus through use, as inoculate, of seeds. The seeds were used for being easy their handling and to produce free individuals of pathogens. As fundamental hypothesis considered that the application of auxins and cytokinins in plantlets obtained from seed of M. coahuilensis var. coahuilensis and E. platyacanthus would induce the formation of shoots. For this investigation the medium of culture of Murashige and Skoog was used (MS) (1962) supplemented with amino acids and vitamins. The seeds of M. coahuilensis var. coahuilensis are small with epigeous germination and in addition are orthodox. Seeds with 42 months of age were used that were divided in two lots. In the first lot 150 seeds were used which became sterile with the following procedure: soapy water by 5 min; rinsing itself with running water; immediately they submerged in ethanol to 70 % by 1 min and later in sodium hypochlorite to 1.2 % by 10 min. Finally three times sterilized desionized water were rinsed. With the second lot the second sowing was realized 290 seeds that became sterile with the following procedure: soapy water by 15 min and soon ethanol to 70 % by 1 min. Later they were introduced in sodium hypochlorite to 1.2 % by 15 min and three times distilled water sterilized were washed. 10 seeds by bottle were seeded, which were in the middle placed MS with 25 % of macro nutriments and sucrose 30 g L-1. The induction of buds was realized in two phases. In first stage 100 seedling were used of germinated seeds test-tube being placed MS medium with 100 % of macronutriments and sucrose 30 g L-1. The treatments were the regulators of growth 6 (γ, γ-dimethylallylamino) purine (2iP), thidiazuron (TDZ) and naphthalenacetic acid (ANA) combined of the following form: 2iP, TDZ, and ANA alone: and 2iP:ANA and ANA:TDZ, varying the concentrations among them. In the second phase, the obtained calluses of the previous phase were inoculated in the same culture medium, but using other concentrations of the growth regulators. The evaluated variables were: germination (%), the index of ratio of germination (seeds/day) (IVG), type and color of callus, number of buds, buds that formed roots (%) and acclimatization (%). With respect to E. platyacanthus, whose seeds that are considered medians and have a epigeous and orthodox germination, a test of viability with chloride of tetrazolium to 0.1 % was realised in 10 seeds of a lot of 50 seeds of the 200 that were had. The age of these seeds was of 10 months. The viability was evaluated and later the rate was determined its percentage of germination. The sterilization of the seed consisted of washing the seed in a soapy running water solution by 20 min and it was rinsed; later min submerged in ethanol to 70 % by 1 min, they went to hypochlorite of sodium to 1.2 % through 15 min and finally three sterilized distilled water rinsing were realized. 10 seeds by bottle were inoculated using MS medium with 100 % of macronutriments and sucrose 30 g L-1. 56 seeds of E. platyacanthus were used and the seedlings obtained of the germinated which were used for the induction of buds. They were inoculated in the MS medium to 100 % and sucrose 30 g L-1. The treatments were the regulators of growth 6 (γ, γ-dimethylallylamino) purine (2iP), thidiazuron (TDZ) and naphthalenacetic acid (ANA) combined of the following form: 2iP, TDZ alone, and ANA: 2iP, ANA: TDZ. Two phases were realized. In the first stage was used the MS medium, but with concentrations different from the cytokinins, and in the second phase, besides varying the concentration of the regulators it supplemented with glutamine (250 mg L-1) and arginine (40 mg L-1). The evaluated variables were: germination (%), the index of ratio of germination (seeds/day) (IVG), type and color of callus, number of buds, buds that formed roots (%) and acclimatization (%). A completely random experimental design was used with ten (M. coahuilensis var. coahuilensis) and five (E. platyacanthus) repetitions, the data analysis was realized using the analysis of variance (ANOVA) with SAS and the mean test was with the test of Tukey (alpha=0.05). The obtained results threw that for M. coahuilensis var. coahuilensis the percentage of germination was of 25.5 % for the first sowing and in second of 26.4 %. The germination average was of 26.0 %. The IVG for the first sowing of 1.6 seeds/day and in the second sowing of 3.6 seeds/day. The type of more common callus was the compact one. The color of more common callus was green and the reddish one that only appeared in means with 2.5 mg L-1 of TDZ. This coloration is possible must to the presence of betalains. The vitrification was observed in the buds worked with TDZ. The greater number of buds appeared in medium with 2.0 mg L-1 of 2iP (0.9 buds/explant in average); apparently the use of 2iP favors the formation of buds which agrees with the answer obtained with other mamilarias. The rooting was of 56.5 % in an average MS to 100 % of the inorganic salts. The spontaneous generation by roots is a normal process in the cactus ones. 92.3 % of acclimated plants were obtained. In E. platyacanthus obtained a low viability of seeds, besides presenting a pale pink coloration the embryos, whereas the percentage of germination was of 32.9 % with a rate of 1.0 seeds/day. With respect to the viability the seeds did not take intense the pink coloration that was expected as it happens to the tests with common orthodox seeds apart from which the same test required of several days. The type of more common callus was the compact one and of green color. The greater number of buds appeared in medium with 0.2 mg L-1 of ANA and 3.0 mg L-1 of 2iP (1.6 buds/explant in average); apparently the use of 2iP favors the formation of buds which agrees with the answer obtained with other species. The rooting was of 100 % in an average MS to 100 % of the inorganic salts.