Purificación y caracterización bioquímica de la aminopeptidasa (tcAPE) de la semilla de cacao (Theobroma cacao L)

Abstract

La aminopeptidasa tcAPE fue parcialmente purificada de semillas germinadas de cacao (Theobroma cacao L.) de diez días de germinación, en cuatro pasos de purificación 1) Homogenización y extracción de la enzima, 2) Precipitación con sulfato de amonio al 60% de saturación, 3) Concentración con el sistema de ultrafiltración Amicon® Millipore empleando una membrana de 10 kDa de corte de peso molecular y 4) Cromatografía de intercambio iónico. La enzima fue parcialmente purificada 6.37 veces con un rendimiento de 56.56%. La tcAPE parcialmente purificada presento cuatro bandas de 131.82 kDa, 122.99 kDa, 80.61 kDa y 22.69 kDa, el cual fue estimado por electroforesis en gel de poliacrilamida a 12%, en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE), con tinción de plata, el cual hidroliza péptidos a temperatura de 50ºC con un pH óptimo de 7.0. El sustrato H-Leu-ρNA fue hidrolizado a una mayor proporción a 10 mM (4.889 UAE/mg de proteína total), seguido de H-Lys- ρNA a 1 mM (1.778 UAE/mg de proteína total) confirmando la presencia de una aminopeptidasa (APE) (E.C. 3.4.11). Sin embargo, también se detectó actividad enzimática de Xaa-Pro-DAP (4.800 UAE/mg de proteína total) con el sustrato H-Ala-Pro-ρNA. No se detectó actividad de la enzima tcCP, con el sustrato Bz-Tyr-ρNA. El sitio activo contiene una serina metaloproteasa, debido a que la actividad enzimática de tcAPE fue inhibida en un 100% por Leupeptina y 81.82% por el agente quelante EDTA. Sin embargo, la actividad de tcAPE parcialmente purificada fue inhibida por los iones de cadmio, mercurio, bario y calcio, lo que nos indica que en su sitio activo está presente un grupo sulfidrilo. _______________ PURIFICATION AND BIOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF AMINOPEPTIDASE (tcAPE) OF THE COCOA BEAN (Theobroma cacao L.). ABSTRACT: tcAPE aminopeptidase was partially purified from germinated seeds of cacao (Theobroma cacao L.) ten days of germination, in four purification steps 1) Homogenization and extraction of the enzyme, 2) precipitation with ammonium sulfate to 60% saturation, 3) Concentration with Amicon ® ultrafiltration system Millipore membrane using a 10 kDa molecular weight cutoff and 4) ion exchange chromatography. The partially purified enzyme was 6.37 times with a yield of 56.56%. The partially purified tcAPE has four bands 131.82 kDa, 122.99 kDa, 80.61 kDa and 22.69 kDa, which was estimated by polyacrylamide gel electrophoresis on 12% denaturing conditions (SDS-PAGE) with silver staining, which peptides hydrolyzed at 50°C with an optimum pH of 7.0. The substrate H-Leu-ρNA was hydrolyzed to a greater share to 10 mM (4.889 UAE / mg of total protein), followed by H-Lys-ρNA to 1 mM (1.778 UAE / mg of total protein), confirming the presence of a aminopeptidase (APE) (E.C.3.4.11). However, enzyme activity was also detected in Xaa-Pro-DAP (4.800 UAE / mg of total protein) with the substrate H-Ala-Pro-ρNA. No activity was detected tcCP enzyme with the substrate Bz-Tyr-ρNA. The active site contains a serine metalloprotease, because the enzyme activity was inhibited tcAPE 100% by leupeptin and 81.82% for the chelating agent EDTA. However, the partially purified tcAPE activity was inhibited by ions of cadmium, mercury, barium and calcium, which indicates that its active site sulfhydryl group is present.