Diseño de oligonucleótidos específicos e inéditos para la detección e identificación del virus del moteado atenuado del chile (PMMoV) en una reacción RT-PCR multiplex.

Abstract

México importa semillas de chile (Capsicum annum) de China, Japón, Francia, España, Turquía, Holanda, EUA y Hungría, países donde se encuentra el virus del moteado atenuado del chile (Pepper mild mottle virus, PMMoV). Este virus ocasiona síntomas de arrugamiento, deformación, moteado amarillo o tonos verdes claros en hojas y frutos afectando la producción en el cultivo de chile. Actualmente, el diagnóstico molecular del virus PMMoV es por reacción RT-PCR usando solo un juego de oligonucleótidos que podrían favorecer la probabilidad de obtener falsos resultados, debido al potencial de mutación del virus o de la alineación de los oligonucleótidos con el genoma de otras especies del género Tobamovirus al cual pertenece el virus PMMoV. El genoma del virus PMMoV está constituido por una molécula de RNA monocatenario, de sentido positivo, con una longitud de 6357 nucleótidos, organizado en cuatro marcos de lectura abierta (ORF) que codifican proteínas esenciales para su ciclo viral. Por lo anterior, el objetivo general fue diseñar oligonucleótidos específicos e inéditos que trabajen en conjunto e hibriden el cDNA diana para la detección e identificación del virus PMMoV que puedan ser utilizados en una reacción RT-PCR multiplex para obtener una mayor especificidad y un poder aumentado de detección. Para esto se diseñaron cinco oligonucleótidos específicos e inéditos: A/A´, B/B´, C/C´, D/D´ y E/E, a partir de 13 secuencias completas disponibles en el GenBank NCBI, con tamaño mínimo de 6300 nucleótidos. De estos solamente los oligonucleótidos C/C´ y E/E´ generaron los amplicones esperados de 417 y 509 pb, respectivamente, en reacciones RT-PCR y RT-PCR multiplex, con temperatura de anillamiento de 64 °C. Los resultados obtenidos en este estudio indican que los oligonucléotidos C/C´ y E/E´ amplifican los sitios catalíticos de las proteínas 30 K, responsable de la replicación, y 17.5 K, de la cápside, respectivamente, del virus PMMoV. _______________ NOVEL SPECIES-SPECIFIC PRIMERS DESIGNED FOR A MULTIPLEX RT-PCR ASSAY FOR DETECTION AND IDENTIFICATION OF THE PEPPER MILD MOTTLE VIRUS (PMMoV). ABSTRACT: Mexico imports pepper seeds (Capsicum annum) from China, Japan, France, Spain, Turkey, the Netherlands, USA and Hungary; countries where the Pepper mild mottle virus (PMMoV) is commonly detected. This virus causes symptoms such as wrinkling, deformation and yellow or light green mottling in leaves and fruits which affects crop production. Currently, molecular diagnosis of the PMMoV virus is performed by RT-PCR using one set of primers, this could favor the probability of obtaining false results due to the mutation rates of the virus or due to alignment of said primers to the genome of other species of the genus Tobamovirus. The PMMoV virus genome is a single-stranded, positive-sense RNA molecule with a length of 6,357 nucleotides, organized into four open reading frames (ORFs) that encode essential proteins for its viral cycle. the main goal of this research was to design specific and unpublished primers that work together and hybridize to the target cDNA for the detection and identification of the PMMoV virus in order to be used in a multiplex RT-PCR reaction to obtain higher specificity and increased detection potential. To achieve this, five specific and unpublished primers were designed: A/A’, B/B’, C/C’, D/D’ and E/E’ using 13 complete genome sequences available in the GenBank database of the NCBI, with a minimum size of 6,300 nucleotides as templates. Only the C/C’ and E/E’ primer pairs generated the expected amplicons of 417 and 509 bp, respectively, in both multiplex RT-PCR and RT-PCR reactions with an annealing temperature of 64 °C. Results obtained in this study indicates that the C/C' and E/E' primer pairs amplify the catalytic sites of the 30 K protein responsible for viral replication and the 17.5 K capsid protein of the PMMoV virus, respectively.