Evaluación in vitro de extractos orgánicos de cuatro plantas contra huevos, larvas infectantes e histiotrópicas de Haemonchus contrortus.

Abstract

La finalidad de la presente investigación fue evaluar la actividad nematicida in vitro de extractos acuosos y metanólicos de Argemone mexicana (Chicalote), Taraxacum officinale (Diente de león), Tagetes filifolia (Anís) y Ruta chalepensis (Ruda) contra larvas infectantes y huevos del nematodo Haemonchus contortus. Las plantas se colectaron en época de floración y fueron identificadas por género y especie. El material vegetal seco y molido se sometió a extracción de sus componentes metabólicos mediante maceración en metanol seguida de maceración en agua destilada. Los extractos se concentraron en un evaporador rotatorio a 50 y 46°C, 90 rpm y vacío constante, posteriormente se liofilizaron y almacenaron a -20°C. Los productos liofilizados se evaluaron in vitro contra huevos, larvas infectantes e histiotrópicas de Haemonchus contortus. En el primer experimento, los resultados mostraron que el extracto metanólico de Tagetes filifolia provoca el 89% de mortalidad de larvas infectantes a 200 mg/mL e inhibe el 100% la eclosión de larvas con 10 mg/mL. Se realizó un fraccionamiento biodirigido, ensayos de cromatografía liquida de alta resolución y resonancia magnética nuclear de la fracción activa, en estos estudios se logró identificar al ácido clogénico como la molécula responsable de la actividad contra huevos y larvas del nematodo con una CL50 de 400 µg/mL. En el segundo experimento, el extracto acuoso de Ruta chalepensis provocó la muerte al 74% de larvas infectantes con 200 mg/mL y 100% de inhibición de la eclosión con 10 y 20 mg/mL. Se realizó una partición con acetato de etilo y se evaluaron cada una de las fases obtenidas, la fase acuosa mostró una actividad inversa a la concentración, causando solamente un 20% de inhibición de la eclosión con 20 mg/mL. Por el contrario la fase de acetato de etilo inhibió 100% de la eclosión en todas las concentraciones de 1.25, 2.5, 5, 10 y 20 mg/mL. La fase de acetato de etilo se sometió a fraccionamiento en columna cromatográfica de sílica gel, se evaluaron 5 fracciones, de las cuales AEC1F4 y AEC1F5 inhibieron la eclosión en un 100% en todas las concentraciones de 2000, 1000, 500 y 250 µg/mL, dados los resultados obtenidos en las placas cromatograficas, se cree que los metabolitos presentes en las fracciones activas, pertenecen al grupo de las cumarinas. Es necesario analizar las muestras mediante de gases masas para identificar las moléculas presentes cada una de las fracciones y responsables de la actividad antihelmíntica. En el tercer ensayo realizado, se evaluaron los extractos metanólicos de las cuatro plantas bajo estudio contra larvas histiotrópicas de Haemonchus contortus. Los extractos metanólicos de Tagetes filifolia y Ruta chalepensis causaron 82 y 88% de mortalidad de larvas histiotrópicas respectivamente, utilizando 200 mg/mL y tras 48 h de confrontación. Los metabolitos secundarios presentes en los extractos de plantas poseen propiedades antihelmínticas, particularmente el extracto metanólico de Tagetes filifolia en el cual se identificó la presencia ácido clorogénico, como principal responsable de la actividad antihelmíntica. La partición de acetato de etilo (AcO) del extracto acuoso de Ruta chalepensis presenta dos fracciones con actividad nematicida. Es importante realizar estudios para identificar a las moléculas responsables de la actividad y evaluar los metabolitos en mamíferos para descartar la posibilidad de presentar efectos secundarios debido al consumo de dichos productos. _______________ ASSESSING THE IN VITRO ACTIVITY OF FOUR PLANT ORGANIC EXTRACTS AGAINST HAEMONCHUS CONTORTUS EGGS AND INFECTIVE AND HISTIOTROPHIC LARVAE. ABSTRACT: This research was aimed to assess the in vitro nematicidal activity of aqueous and methanolic extracts of the plants Argemone mexicana (Chicalote), Taraxacum officinale (Diente de Leon), Tagetes filifolia (Anís) and Ruta chalepensis (Ruda) against Haemonchus contortus eggs and infective and histotrophic larvae. Plants were collected during flowering and they were identified to obtain their genera and species. Plant material was dried and grinded and the extracts were obtained through the methanolic maceration process followed by maceration in distilled water. The extracts were concentrated using a rotatory evaporator at 50 and 46ºC, 90 rpm and continuous vacuum and eventually lyophilized and kept at –20ºC. Lyophilized extracts were in vitro evaluated against H. contortus eggs as well as against infective and histotrophic larvae. In a first experiment, the results showed that T. filifolia methanolic extract caused 89% mortality of infective larvae at 200 mg/mL. Likewise, this extract caused 100% egg hatching inhibition (EHI) at 10 mg/mL. Derived from these results, a bio-directed fractioning was performed were the high performance liquid chromatography and the nuclear magnetic resonance of the active fraction revelled the presence of chlorogenic acid as the molecule responsible of the nematocidal activity against eggs of the nematode with a CL50=400 µg/mL. In a second experiment, the Ruta chalepensis aqueous extract caused 74% larval mortality at 200 mg/mL; meanwhile, at 10 and 20 mg/mL caused 100% EHI. Based on these results, an Ethyl acetate partition was performed and each of the phases obtained were evaluated; where the aqueous phase showed a nematocidal activity inversely proportional to the concentration and only 20% EHI was obtained at 20 mg/mL. In contrast, the Ethyl acetate phase caused 100% EHI at all assessed concentrations (1.25, 2.5, 5, 10 y 20 mg/mL). From this experiment, The Ethyl acetate phase was fractioned using a silica gel column chromatography where five fractions were evaluated. From these fractions, AEC1F4 and AEC1F5 fractions caused 100% EHI at the whole assessed concentrations (2000, 1000, 500 and 250 µg/mL). From the results observed in the thin layer chromatography about the active fractions is thinking that, the active molecule corresponds to a group of the coumarins, it is necessary to analyze the samples to by Gas chromatography and mass spectrometry to identify the molecules present in each of the fractions responsible for the nematocidal activity. In the third assay, the methanolic extracts of the four plants were assessed against histotrophic larvae of the parasite. The T. filifolia and R. chalepensis methanolic extracts caused 82 and 88% larval mortality, respectively at 200 mg/mL after 48 hours confrontation. The secondary metabolites present in the plant extracts possess nematocidal properties, particularly the T. filifolia methanolic extract in which chlorogenic acid was identified as the main compound responsible of the nematocidal activity. The Ethyl acetate partition of the R. chalepensis aqueous extract possesses two nematocidal fractions. These fractions will be considered for future studies focussed to identify the bioactive compounds present in each of them and evaluate if can cause secondary effects in mammals.