El virus de la tristeza de los cítricos (CTV): bases moleculares, biológicas y epidemiológicas para establecer un programa de protección cruzada.

Abstract

Los aislados reportados del Citrus Tristeza virus (CTV) en México son de tipo moderado y al presente no inducen síntomas en cítricos injertados en naranjo agrio (Citrus aurantium L.), considerado altamente susceptible, a diferencia de otros países del mundo donde se han reportado aislados severos que inducen síntomas de decaimiento rápido, acanaladuras en corteza y amarillamiento de plántulas. El objetivo general de esta investigación fue la caracterización de 168 aislados de CTV seleccionados por origen regional pertenecientes a la colección in vivo del Colegio de Postgraduados (COLPOS) y provenientes de muestreos de campo para determinar la variabilidad genética y patogénica del CTV a 15 años de introducción en México de Toxoptera citricida (Hemiptera: Aphididae) (Tc), considerado un vector eficiente y selectivo de aislados severos. Durante invierno de 2013 y 2014, se obtuvieron 104 muestras positivas de 38 huertos de la Península de Yucatán (87 Yucatán; 13, Campeche, y 4 Quintana Roo) con el fin de actualizar la colección del COLPOS consistente en 64 aislados. Se enfatizó esta región por ser el área de ingreso de Tc a México en 2000. Adicionalmente, en 2015 se realizó un muestreo dirigido a un huerto de naranja dulce (C. sinensis (L.) Osbeck) de Veracruz. Para la variabilidad genética se caracterizaron los aislados mediante cuatro genes: ARN polimerasa ARN-dependiente (RdRp), p33, proteína de la cápside (CP), y p13, putativamente asociados con patogenicidad. La extracción de ARN se realizó por el método de CTAB y la RT-PCR por punto final utilizando los primers específicos para cada gen. El estudio de diversidad y filogenia se realizó en dos etapas. En etapa 1, un total de 168 aislados fueron secuenciados con el método de Sanger y analizados con MEGA6 para establecer la estructura poblacional de aislados severos y moderados y la prevalencia regional. Los aislados T30 y T36 se usaron como controles moderados y severos, respectivamente. En etapa 2, se concretó el estudio filogenético con un total de 25 aislados. De estos, 8 aislados (3 aislamientos de Yucatán, 3 de Veracruz y 2 de Tamaulipas) fueron seleccionados a partir de resultados de etapa 1 por su prevalencia y homología de secuencias para comparar su variabilidad con secuencias del GeneBank de 9 aislamientos mexicanos previos al ingreso de Tc. Con fines comparativos se incluyeron las secuencias de 8 aislados de otros países: T30 y T385 (moderados) y T36, VT, SY569, NUagA, NZ-M16 y NZ-B18 (severos). Todos los aislados, excluyendo uno de Veracruz (Mx-Caz-Ver KX029095) fueron de tipo moderado con una homología mayor a 99% para los genes p33, CP y p13. El gen RdRp no generó una clara agrupación de severos y moderados, sugiriendo que no está involucrado con patogenicidad. La diversidad de secuencias del ARN genómico (gRNA) de los 8 aislamientos analizados tuvo un patrón de divergencia similar al observado entre aislados provenientes de un periodo previo a la introducción y dispersión de Tc en México. Estos resultados sugieren que Tc no está aparentemente induciendo cambios en la estructura poblacional de CTV hacia una prevalencia de variantes severas en México. Para la caracterización biológica se seleccionaron 7 aislamientos mexicanos (Yucatán 3, Veracruz 2 y Tamaulipas 2) representativos del grupo filogenético moderado con la mayor prevalencia regional. Cada aislamiento fue inoculado por medio de injerto (2-3 yemas) en plantas de 12 meses de edad de limón mexicano (C. aurantifolia Swing), naranjo agrio, toronja “Duncan” (C. paradisi Macfad.) y naranja dulce (C. sinensis) sobre naranjo agrio. Un total de 84 plantas fueron mantenidas a temperaturas de 18 a 24 ºC durante 12 meses en el invernadero de la Estación Nacional de Cuarentena, Epidemiología y Saneamiento Vegetal (ENECUSaV-SENASICA). Todas las plantas fueron mensualmente evaluadas por seis meses a partir del segundo mes después de la inoculación para la detección de CTV mediante PCR en tiempo real y para el tipo e intensidad de síntomas (reducción del crecimiento, acortamiento de entrenudos, reducción de unidades clorofila, amarillamiento, aclaramiento de nervadura, acucharado de hoja y picado de tallo). T1-Yuc y T2-Yuc 2 no indujeron ningún tipo de síntoma, excepto un débil acucharado en limón mexicano. Las plantas de naranjo agrio, naranja dulce sobre naranjo agrio y toronja infectadas con los aislamientos T7-Ver, T4-Ver y T4-Ver, respectivamente, tuvieron reducción del crecimiento de 7.7 cm, 13.9 cm y 6,6 cm (P ≤ 0.05) y también presentaron acortamiento de entrenudos de hasta 2 cm para naranja dulce sobre agrio con T4-Ver (P ≤ 0.05). En limón mexicano T4- Ver y T6-Tams indujeron síntomas de acucharado de hoja y aclaramiento de nervaduras, pero en todos los casos dentro de un rango de severidad débil (1) a moderado (2), según una escala arbitraria de 0 (sana) a 3. No se observó la presencia de picado de tallo en las diferentes plantas indicadoras. En ninguna especie indicadora hubo diferencias en la reducción de las unidades clorofila medidas con el equipo SPAD 502 plus (P ≤ 0.05). Este estudio soporta la viabilidad de algunos de estos aislamientos, seleccionados regionalmente, para un programa de protección cruzada en México, en particular en la combinación naranjo dulce sobre naranjo agrio. Finalmente, con las variantes de secuencia obtenidas de los 168 aislamientos, los cuales conformaron 5 haplotipos, se desarrolló un modelo para simular la aparición de nuevos haplotipos de CTV para la Península de Yucatán, región endémica con Tc. El modelo se complementó con datos de 18 huertas (16 Yucatán y 2 Campeche) con antecedentes de la enfermedad usando variables del sistema epidemiológico (% de incidencia, edad de huerto, superficie, densidad de plantación, brotes maduros y tiernos, infestación del vector, tipo de riego y temperatura mínima en meses de brotación vegetativa). La predicción del modelo fue obtenida a través de la examinación del coeficiente de correlación de Pearson y por regresión múltiple con el método de Ridge. La selección del modelo fue basada en la proporción de varianza explicada, gráficos de residuos y del factor de inflación de varianza. El modelo (R2=0.94) fue adaptado en MS-Excel al método de simulación Monte Carlo con 5000 iteraciones. En una proyección de 10 años se estimó un total de 11 haplotipos de CTV en el rango de moderados, 6 adicionales a los actualmente presentes en la Península de Yucatán. Estos resultados sugieren una aparente estabilidad de estructura poblacional del CTV en México y el reducido efecto de Tc. Este estudio demuestra que el vector Tc, bajo vigilancia epidemiológica en México, no ha tenido un fuerte efecto en la dispersión de aislados severos. Sin embargo, la estructura poblacional puede ser alterada a partir de un eventual incremento de aislados severos introducidos por vía vegetativa u otros medios, incluyendo Tc u otros vectores. La alta prevalencia natural de aislados moderados sugiere que la protección cruzada podría ser una alternativa para el manejo de la enfermedad. _______________ CITRUS TRISTEZA VIRUS (CTV): MOLECULAR, BIOLOGICAL AND EPIDEMIOLÓGICAL BASES TO ESTABLISH A CROSS PROTECTION PROGRAM. ABSTRACT: In Mexico, the reported CTV isolates are of moderate type and exempt of visual symptoms even on citrus propagated on sour orange plants (Citrus aurantium L.), considered highly susceptible, unlike other countries where severe isolates had been reported causing symptoms of quick decline, ribbed wood and yellowing of seedling. The overall aim of this research was the characterization of 168 isolates selected by regional origin from the collection in vivo of the Colegio de Postgraduados and field sampling to determine the genetic and pathogenic variability of CTV after 15 years of Toxoptera citricida (Hemiptera: Aphididae) (Tc) introduction to the country, considered the most efficient vector and selective of severe isolates. During the winter of 2013 and 2014, 104 positive samples from 38 orchards in the Peninsula of Yucatan were obtained (87 in Yucatán, 13 and 4 in Campeche and Quintana Roo, respectively) in order to update the COLPOS collection of 64 isolates. This region was emphasized by being the entry area of Tc in Mexico in 2000. Additionally, in 2015 directed sampling in a sweet orange orchard (C. sinensis (L.) Osbeck) of Veracruz was performed. The genetic variability of CTV was characterized using four genes: RNA polymerase RNA-dependent (RdRp), p33, capsid protein (CP) and p13, putatively associated with pathogenicity. RNA extraction by CTAB method and RT-PCR was performed by endpoint PCR using primers specific for each gene. The diversity and phylogeny study was conducted in two stages. In Stage 1, a total of 168 isolates were sequenced with the Sanger method and analyzed with MEGA6 to establish the population structure of severe and moderate isolates and their regional prevalence. T30 and T36 isolates were used as moderate and severe controls, respectively. In Stage 2, a total of 25 isolates were used. Of these, 8 isolates (3 isolates Yucatan 3 of Veracruz and 2 of Tamaulipas) were selected from the step 1 by prevalence and homology to compare variability with sequences of GenBank of 9 Mexican isolates prior to the entry of Tc. Sequences of other countries isolates were included: T30 and T385 (moderate) and T36, VT, SY569, NUagA, NZ-NZ-B18 and M16 (severe). All isolates, excluding one of Veracruz (Caz-Ver) were moderate with a homology greater than 99% for p33, CP and p13 genes. The RdRp gene had no clear grouping of severe and moderate, suggesting that is not involved with pathogenicity. The diversity of genomic RNA sequences (gRNA) of the 8 isolates analyzed had a pattern similar to that observed among isolates prior to the entrance of Tc in the country. These results suggest that Tc is not apparently inducing changes in the CTV population structure to a prevalence of severe strains in Mexico. For biological characterization, 7 Mexican isolates (3 of Yucatan, 2 of Veracruz and 2 of Tamaulipas) were selected from the moderate phylogenetic group with highest regional prevalence. Each isolate was inoculated by grafting (2-3 buds) in plants of 12 moth age of Mexican lime (C. aurantifolia Swing), sour orange, grapefruit "Duncan" (C. paradisi Macfad.), and sweet orange (C. sinensis) on orange sour. A total of 84 plants were kept at 18 to 24°C for 12 months under greenhouse at the Estación Nacional de Cuarentena, Epidemiología y Saneamiento Vegetal (ENECUSaV-SENASICA). During six months, all plants were monthly evaluated starting from the second month after inoculation, for CTV detection by real-time PCR and for type and symptoms intensity (reduced growth, shortening, chlorophyll reduction units, yellowing, rib clearance, leaf cupping and stem pitting). T1-Yuc y T2-Yuc do not induced any type of symptoms except a weak leaf curling in Mexican lime. Plants of sour orange, sweet orange on sour orange and grapefruit infected with T7-Ver, T4-Ver and T4-Ver isolates, respectively, had reduced growth of 7.7, 13.9 and 6.6 cm (P ≤ 0.05) and also presented internode shortening of up to 2 cm in sweet orange on orange sour (P ≤ 0.05). T4-Ver and T6-Tams induced in Mexican lime leaf curling and ribs symptoms within a range of weak (1) to moderate severity (2) according to arbitrary scale of 0 (healthy) to 3. Not presence of stem pitting in was observed. Also, no differences were found in chlorophyll reduction measured with SPAD 502 Plus (P ≤ 0.05). This study supports the viability of some isolates, selected regionally, in a cross-protection program in Mexico, in particular for the in sweet orange / sour orange combination. Finally, with the sequence variants of the 168 isolates obtained, represented in 5 haplotypes, a model for simulation of new CTV haplotypes was developed for the Peninsula of Yucatan, endemic region for TC. The model was enhanced using data from 18 orchards (16 in Yucatan and 2 in Campeche) with disease presence and eight epidemiological variables (% of incidence, orchard age, planting area, planting density, mature and young shoots, vector infestation, irrigation type and minimum temperature during the shooting period). The prediction model was obtained through examination of the Pearson correlation coefficient and multiple regression by Ridge method. The selection of the model was based on the proportion of variance explained, residual plots and variance inflation factor. The model (R2=0.94) was adapted into MS-Excel to Monte Carlo simulation method with 5000 iterations. A total of 11 moderate haplotypes of CTV were estimated in a 10 years projection, six additional to the current five. These results suggest an apparent stability of the CTV population structure in Mexico, and the reduced effect of Tc. This study shows that Tc, under official epidemiological surveillance, has not a significant dispersion effect of severe isolates in Mexico. However, the population structure can be altered if severe isolates are introduced through vegetative material or other means, including Tc or other vectors. Natural high prevalence of moderate isolates suggests that cross-protection could be an alternative for disease management.