Estandarización y validación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de especies del género Xyleborus

Abstract

La apertura de México al libre comercio ha incrementado el riesgo de introducción de plagas exóticas, entre los que se encuentran el complejo Xyleborus glabratus-Raffaela lauricola que de llegar a México podría impactar la producción de aguacate Persea amaricana, en el país. Por tal motivo el objetivo de este estudio fue estandarizar y validar la técnica de PCR-anidada para la detección rápida, sensible y confiable de especies del género Xyleborus, utilizando los “primers” externos CI-J-2183 y TL2-N-3014; e internos J2210 y N2739 que amplifican una banda de ~1 300 y 500 pb respectivamente, de una región del gen mitocondrial citocromo oxidasa subunidad 1 (CO1). Asimismo, se realizó la extracción de ADN de 26 ejemplares de Xyleborus con el kit Qiagen DNeasy® mericom Food (DMF), no reportado previamente su uso para su aplicación en insectos, que resultó en ADN suficiente y de alta calidad para reacciones de amplificación por PCR. El método permitió procesar un solo insecto por extracción, y obtener material genético de muestras conservadas en alcohol de hasta ocho años de antigüedad. El límite de detección se definió hasta una concentración de 780 pg/μl. Se optimizó la PCR en un volumen final de 15 µL sin comprometer calidad de la amplificación. La técnica estandarizada permitió la obtención de ADN de calidad, lo que aseguró alta reproducibilidad y sensibilidad en la detección de especies de Xyleborus y la secuenciación parcial del gen CO1 para las siete especies estudiadas; las secuencias consenso fueron analizadas por homología y sometidas al GenBank para su publicación. _______________ ABSTRACT: The opening of Mexico to free trade has increased the risk of the introduction of exotic pests, among which is the complex Xyleborus glabratus-Raffaela lauricola that reach Mexico, could impact the production of avocado Persea americana, in the country. For this reason, the objective of this study was to standardize and to validate the nested PCR test for rapid, sensitive and reliable detection of species of the genus Xyleborus using external "primers" CI-J-2183 and TL2-N-3014 and internal primers J2210 and N2739 that amplify a band of between 1300 and 500 pb in the region of the mitochondrial Cytochrome Oxidase subunit I gene (CO1). Also, ADN extraction from 26 specimens of Xyleborus was realized with kit Qiagen DNeasy ® mericom Food (DMF), not previously reported its use for their application in insects, which resulted in enough ADN and high-quality for amplification by PCR reactions. The method allowed to process a single insect by extraction, and obtain genetic material from specimens preserved in alcohol of up to eight years old. The detection limit was defined up to a concentration of 780 pg/μL. The PCR was optimized in a final volume of 15 µL without compromising quality of amplification. The standardized test allowed quality ADN, which ensured high reproducibility and sensitivity in the detection of species of Xyleborus and partial sequencing of the CO1 gene to the seven species studied; consensus sequences were analyzed by homology and deposited in the GenBank for their publication.