Caracterización de Colletotrichum spp. en frutos de papaya cv. 'maradol' de diferentes estados de la República Mexicana y su control postcosecha.

Abstract

La papaya (Carica papaya L.) es una fruta altamente perecedera, por lo que el control de la maduración es esencial para aumentar la vida útil, así como disminuir los síntomas de la antracnosis y teniendo en cuenta los recientes avances taxonómicos en la sistemática del género Colletotrichum, este trabajo se dividió en cinco fases con los siguientes objetivos: 1ra. fase, caracterizar molecular, morfológica y patogénicamente diferentes especies de Colletotrichum spp. en frutos de papaya cv. Maradol de diferentes estados de la República Mexicana, 2da: determinar la composición fitoquímica del extracto etílico vegetal de hojas de guayaba (Psidium guajava), así como la evaluación de la efectividad biológica in vitro sobre seis especies de Colletotrichum para el manejo de la antracnosis en frutos de papaya cv. Maradol, 3ra: evaluar el efecto de un recubrimiento comestible a base de carboximetilcelulosa 0.5 % adicionado con extracto etanólico de hoja de guayaba (Psidium guajava) sobre la calidad y el control de tres especies de Colletotrichum spp. en papaya cv. Maradol, 4ta: evaluar la actividad antifúngica de cinco plantas medicinales de uso frecuente en Brasil (Annona muricata, Azadirachta indica, Baccharis trimera, Guarea trichilioides, Zingiber officinale) de forma in vitro sobre Colletotrichum sp. para el control de la antracnosis en frutos de papaya y 5ta: evaluar los tratamientos: agentes de control biológico (Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma harzianum, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens), químico (azoxistrobin, cloruro de calcio, fosfito de potasio) y extractos vegetales (extracto comercial de jengibre y de guanábana), en la calidad y control de antracnosis en frutos de papaya cv. Sunrise. En la metodología de la 1er fase se utilizaron muestras de material enfermo que se colectaron de 23 municipios de 10 estados productores. El aislamiento de Colletotrichum spp. se realizó con el método monospórico y de cámara húmeda, posteriormente se hizo una extracción de ADN genómico, amplificación de Reacción en Cadena de Polimesara con región Espacio de transcripción interna y genes que codificaron para Actina, secuenciación en Macrogen y un análisis filogenético mediante un alineamiento multilocus con dos genes combinados (ITS y ACT) usando el programa SeaView. La caracterización morfológica (coloración de las cepas, aspecto, crecimiento del micelio, forma y tamaño de conidios, tasa de esporulación) y prueba de patogenicidad (crecimiento miceliar de cepa en frutos de papaya) se llevó acabo con seis aislamientos que resultaron diferentes en su identificación con ACT (C. cliviae: V22, C. truncatum: Co19, C. brevisporum: T15, C. karstii: M15, C. aenigma: V39, C. gloeosporioides: G15). En la 2da fase la obtención de los extractos se utilizaron hojas de guayaba silvestre cv ‘Criolla’ y se empleó el método de extracción asistida por ultrasonido de baja frecuencia; la identificación de flavonoides en los extractos se hizo por cromatografía de líquidos de alta resolución y electroforesis capilar; y para la evaluación de su actividad antifúngica se realizó por el método de microdilución-difusión en agar, probando cinco concentraciones del extracto etílico: 100, 150, 200, 250 y 300 ppm de extracto para seis especies de Colletotrichum (C. aenigma, C. brevisporum, C. cliviae, C. gloeosporioides, C. karstii y C. truncatum) previamente aisladas e identificadas de frutos de papaya cv ‘Maradol’. En la 3er fase se utilizaron papayas cv. Maradol que fueron lavadas con agua y jabón, desinfestadas con hipoclorito de sodio al 2%, enjuagadas, secadas, inoculadas con 50 µL de una suspensión de esporas de Colletotrichum spp. (6 x 105 esporas/mL) de cada cepa estudiada (C. gloeosporioides, C. truncatum, y C. brevisporum) en una zona específica del fruto (cinco zonas por fruto y se trabajó con cuatro frutos por tratamiento), incubados (en cámara húmeda 24 h a 25°C), cabe aclarar que la inoculación e incubación solo se realizó en frutos asignados para la prueba de severidad. Las papayas fueron sometidas a diversos tratamientos [1: sin recubrimiento (SR), 2: con recubrimiento sin adición de extracto (CR), 3: con recubrimiento y adición de extracto (CRE)] por inmersión durante tres min, secadas y almacenadas (15°C por 12 d), evaluando cada dos días parámetros de calidad (color, sólidos solubles totales, acidez titulable, vitamina C, firmeza, pérdida de peso), respiración y efecto antifúngico contra la antracnosis (índice de severidad). En la 4ta fase la obtención de extractos se realizó con hojas de plantas (Annona muricata, Azadirachta indica, Baccharis trimera, Guarea trichilioides y Zingiber officinale) y se obtuvieron por el método de maceración y su actividad antifúngica se realizó con el método de microdilución-difusión en agar, probando cinco concentraciones del extracto (0, 50, 100, 150 y 200 ppm) contra Colletotrichum sp. En la 5ta fase el estudio tuvo dos partes: en la primera se seleccionaron los tres mejores tratamientos, uno de cada tipo (biológico, químico, extracto vegetal) en función de su efecto antifúngico sobre Colletotrichum sp. y en la segunda se evaluó el efecto postcosecha que cada tratamiento seleccionado sobre los parámetros de calidad [pérdida de peso, color, firmeza, sólidos solubles totales (SST), pH, acidez titulable (AT), contenido de ácido ascórbico (AA)]. Con los resultados de la 1ra fase se determinó que la principal especie asociada a la antracnosis en papaya fue C. brevisporum con una frecuencia del 60% en los aislados evaluados. En la 2da fase los resultados mostraron que el extracto de guayaba principalmente presentó los polifenoles: florizidina, epicatequina, quercitina, catequina y ácido ascórbico. En la actividad antifúngica se mostró que, a mayor concentración del extracto, mayor fue el efecto inhibitorio y que la concentración de 300 ppm fue la óptima para controlar el 100% de crecimiento de las seis especies evaluadas, además de que se tuvo efecto significativo entre cada especie evaluada. En la 3ra fase los resultados mostraron que las papayas CR tuvieron significancia en los parámetros evaluados (color, sólidos solubles totales, acidez titulable, vitamina C, pérdida de peso, firmeza y respiración) con respecto a los no recubiertos (SR), en el índice de severidad también se mostró diferencia significativa, pero fue aún mayor en recubrimientos con la adición de extracto (CRE). En la 4ta fase el extracto de hojas de guanábana (A. muricata) presentó el mayor contenido de fenoles y provocó la mayor actividad antimicrobiana sobre Colletotrichum sp., a una concentración de 200 ppm de este mismo extracto ya que se obtuvo el 100% de inhibición del mismo hongo. En la 5ta fase como resultado de la primera fase se obtuvo que los tres mejores métodos de cada tipo para el control de antracnosis fueron: T. longibrachiatum, cloruro de calcio y extracto comercial de jengibre, con los que se disminuyó un 67, 42 y 60% menor índice de severidad, respectivamente con respecto al control. _______________ CHARACTERIZATION OF Colletotrichum spp. IN FRUITS OF PAPAYA CV. 'MARADOL' FROM DIFFERENT STATES OF THE MEXICAN REPUBLIC AND POST-HARVEST CONTROL. ABSTRACT: The papaya (Carica papaya L.) is a highly perishable fruit, so the control of maturation is essential to increase the shelf life, as well as decrease the symptoms of anthracnose and taking into account the recent taxonomic advances in the systematics of the genus Colletotrichum, this work was divided into five phases with the following goals: 1st. phase, characterize molecularly, morphologically and pathogenically different species of Colletotrichum spp. isolated from fruits of papaya cv. Maradol, harvested from different states of the Mexican Republic, 2nd, determine the phytochemical composition of the vegetable ethyl extract of guava leaves (Psidium guajava), as well as the evaluation of the in vitro biological effectiveness on six species of Colletotrichum for the management of anthracnose in papaya fruits cv. Maradol, 3rd, evaluate the effect of an edible coating based on 0.5% carboxymethylcellulose added with ethanolic extract of guava leaf (Psidium guajava) on the quality and control of three species of Colletotrichum spp. in papaya cv. Maradol, 4th: to evaluate the antifungal activity of five medicinal plants frequently used in Brazil (Annona muricata, Azadirachta indica, Baccharis trimera, Guarea trichilioides, Zingiber officinale) in vitro on Colletotrichum sp. for the control of anthracnose in papaya, and 5th, fruits evaluate the treatments: biological control agents (Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma harzianum, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens), chemical (azoxystrobin, calcium chloride, potassium phosphite) and plant extracts (commercial extract of ginger and guanábana), in the quality and control of anthracnose in fruits of papaya cv. Sunrise. In the methodology of the 1st phase, samples of diseased material were used and collected from 23 municipalities in 10 producing states. The isolation of Colletotrichum spp. was performed with the monosporic and wet-chamber method, then an extraction of genomic DNA was carried out, Polymerase Chain Reaction amplification with region of Internal Transcription Space and genes that codified for Actin, sequencing in Macrogen and a phylogenetic analysis through an alignment multilocus with two genes combined (ITS and ACT) using the SeaView program. The morphological characterization (coloration of the strains, appearance, growth of the mycelium, shape and size of conidia, sporulation rate) and pathogenicity test (mycelial growth of strain in papaya fruits) was carried out with six isolations that were different in their identification with ACT (C. cliviae: V22, C. truncatum: Co19, C. brevisporum: T15, C. karstii: M15, C. aenigma: V39, C. gloeosporioides: G15). In the 2nd phase the extracts were obtained using wild guava leaves cv 'Criolla' and the method of low frequency ultrasound-assisted extraction was used; the identification of flavonoids in the extracts was done by high performance liquid chromatography and capillary electrophoresis; and for the evaluation of its antifungal activity was performed by the method of microdilution-diffusion in agar, testing five concentrations of the ethyl extract: 100, 150, 200, 250 and 300 ppm of extract for six species of Colletotrichum (C. aenigma, C brevisporum, C. cliviae, C. gloeosporioides, C. karstii, and C. truncatum) previously isolated and identified from papaya cv 'Maradol' fruits. In the 3rd phase, papayas cv. Maradol were washed with soap and water, disinfected with 2% sodium hypochlorite, rinsed, dried, inoculated with 50 μL of a spore suspension of Colletotrichum spp. (6 x 105 spores/mL) of each strain studied (C. gloeosporioides, C. truncatum, and C. brevisporum) in a specific area of the fruit (five zones per fruit and worked with four fruits per treatment), incubated (in wet chamber 24 h at 25 °C), it should be clarified that the inoculation and incubation was only performed on fruits assigned for the severity test. The papayas were subjected to various treatments [1: uncoated (SR), 2: coated without addition of extract (CR), 3: with coating and addition of extract (CRE)] by immersion for three min, dried and stored (15 °C for 12 d), evaluating quality parameters every two days (color, total soluble solids, titratable acidity, vitamin C, firmness, weight loss), respiration and antifungal effect against anthracnose (severity index). In the 4th phase, extracts were obtained with leaves of plants (Annona muricata, Azadirachta indica, Baccharis trimera, Guarea trichilioides, and Zingiber officinale) and were obtained by the maceration method and their antifungal activity was performed with the microdilution method agar diffusion, testing five concentrations of the extract (0, 50, 100, 150, and 200 ppm) against Colletotrichum sp. In the 5th phase the study had two parts: in the first, the three best treatments were selected, one of each type (biological, chemical, vegetal extract) based on its antifungal effect on Colletotrichum sp., and in the second, the postharvest effect of each treatment selected on the quality parameters [weight loss, color, firmness, total soluble solids (SST), pH, titratable acidity (AT), ascorbic acid content (AA)] was evaluated. With the results of the 1st phase it was determined that the main species associated with anthracnose in papaya was C. brevisporum with a frequency of 60% in the isolates evaluated. In the 2nd phase the results showed that the guava extract mainly presented the polyphenols: florizidin, epicatechin, quercitin, catechin, and ascorbic acid. In the antifungal activity, it was shown that, the greater the concentration of the extract, the greater the inhibitory effect and the 300 ppm concentration was the optimum to control the 100% growth of the six species evaluated, as well as having a significant effect between each evaluated species. In the third phase the results showed that the papayas CR had significance in the evaluated parameters (color, total soluble solids, titratable acidity, vitamin C, weight loss, firmness and respiration) with respect to the uncoated (SR), in the severity index also showed significant difference, but was even higher in coatings with the addition of extract (CRE). In the 4th phase, the guanabana leaves extract (A. muricata) had the highest phenol content and caused the highest antimicrobial activity on Colletotrichum sp., at a concentration of 200 ppm of this same extract, since 100% was obtained inhibition of the same fungus. In the 5th phase as a result of the first phase it was obtained that the three best methods of each type for the control of anthracnose were: T. longibrachiatum, calcium chloride and commercial extract of ginger, with which it decreased by 67, 42 and 60% lower severity index, respectively with respect to control.