Expresión de genes en naranjo dulce (Citrus sinensis) inoculado con Candidatus Liberibacter asiaticus.

Abstract

Para determinar la expresión diferencial de genes en naranjo dulce (Citrus sinensis/Citrus aurantium), inoculado con dos cepas de inducción patogénica contrastante de CLas (Candidatus Liberibacter asiaticus) y como testigo comparativo, una cepa T30 de CTV (Citrus tristeza virus), se desarrolló a partir de extracción total de ARN de nervadura central de hoja de naranjo dulce positiva a CLas y CTV un protocolo de RT-qPCR no comercial, empleando GAPDH y Actin como genes de referencia. Los resultados de RT-qPCR revelaron que la inoculación indujo diferente expresión de genes en respuesta a Candidatus Liberibacter asiaticus cepa asintomática (CLas-A), CLas sintomática (CLas-S) y CTV en condiciones de invernadero. En hojas perodicamente muestreadas, la infección se confirmó por qPCR a partir de 3.5 meses después de inoculación (MDI) con CTV, 4.5 MDI y 6 MDI con CLas-S y CLas-A, respectivamente. Con lo anterior se evidenció una rápida infección de CTV comparada con la infección de ambas cepas de Clas. Las plantas inoculadas con CLas-A al tiempo 6 MDI registraron el mayor valor de la expresión de TIB-NBS-LRR (1.37), seguida por la expresión de WRKY70 (0.88) mientras que los genes PP2-B13, NB-ARC y CDR13 mostraron valores de expresión menores (0.44, 0.52, 0.4 respectivamente). Las plantas inoculadas con CTV vuelven a presentar los mayores valores de expresión en todos los genes que las inoculadas con cualquiera de los dos inóculos de CLas TIB-NBS-LRR (2.06), WRKY70 (1.35), PP2-B13 (1.12), NB-ARC (1.88) y CDR13 (3.17). Podemos decir que bajo las presentes condiciones experimentales la expresión diferencial de los genes que induce CLas-A está contribuyendo a la condición asintomática de las plantas de naranjo inoculadas, induciendo la sobreexpresión de todos los genes. La diferencia entre plantas inoculadas con CLas-A y plantas inoculadas con CLas-S a 6 MDI es la sobreexpresión de los cinco genes en el primero y la reducción en la expresión en el segundo. A los 12 MDI los valores disminuyen al inocular con CLas-A y se mantienen al inocular con CLas-S. La expresión de los genes TIB- NBS-LRR (p=0.06) y NB-ARC (p=0.02), asociadas a de proteínas ricas en leucina, en respuesta a los agentes patógenos en plantas con CLas-S se expresan hasta 12 MDI. Mientras que en CLas-A (p=0.01) la expresión fue a los 6 MDI, principalmente de WRKY70 activador de otros genes de defensa dependientes de acido salicílico. La mayor regulación de CDR13 (p=0.06), putativamente relacionado a resistencia a enfermedades constitutivas, fue en CTV. La regulación de PP2-B13, relacionada con la proteína del floema, para CLas-S fue baja (p=0.28) contrario a CTV (p=0.06). _______________ GENE EXPRESSION IN SWEET ORANGE (Citrus sinensis) INOCULADE WITH Candidatus Liberibacter asiaticus. ABSTRACT: To determine the differential expression of genes in sweet orange tree (Citrus sinensis / Citrus aurantium), inoculated with two contrasting pathogenic induction strains of CLas (Candidatus Liberibacter asiaticus), and as a comparative control, a T30 of CTV (Citrus tristeza virus) was usedeveloped from total extraction of CLas positive and CTV positive leaf midrib RNA a non-commercial protocol, of RT-qPCR using as reference gene: GAPDH and Actin. The RT-qPCR results revealed that inoculation induced different gene expression in response to asymptomatic Candidatus Liberibacter asiaticus strain (CLas-A), symptomatic CLas (CLas-S) and CTV under greenhouse conditions. In sampled leaves, the infection confirmed by qPCR at 3.5 months after inoculation (MDI) for CTV, for CLas-S at 4.5 MDI and CLas-A at 6 MDI, these data evidenced rapid infection compared to infection by both strains of CLas. The RT-qPCR results revealed that inoculation induced different gene expression in response to Candidatus Liberibacter asiaticus asymptomatic strain (CLas-A), symptomatic CLas (CLas-S), and CTV under greenhouse conditions. In periodically sampled leaves, the infection was confirmed by qPCR starting 3.5 months after inoculation (MDI) with CTV, 4.5 MDI, and 6 MDI with CLas-S and CLas-A, respectively. With the above, a rapid CTV infection was evidenced compared to the infection of both CLas strains. Plants inoculated with CLas-A at time 6 MDI recorded the highest value of the expression of TIB-NBS-LRR (1.37), followed by the expression of WRKY70 (0.88) while the genes PP2-B13, NB-ARC, and CDR13 showed lower expression values (0.44, 0.52, 0.4 respectively). Plants inoculated with CTV once again show the highest expression values in all genes than those inoculated with either of the two inoculants of CLas TIB-NBS-LRR (2.06), WRKY70 (1.35), PP2-B13 (1.12), NB -ARC (1.88) and CDR13 (3.17). We can say that under the present experimental conditions the differential expression of the genes that induces CLas-A is contributing to the asymptomatic condition of the inoculated orange plants, inducing the overexpression of all the genes. The difference between plants inoculated with CLas-A, and plants inoculated with CLas-S at 6 MDI is the overexpression of the five genes in the first and the reduction in the expression in the second at 12 MDI, the values decrease when inoculating with CLas-A and are maintained when inoculating with CLas-S the expression of the genes TIB-NBS-LRR (p = 0.06) and NB-ARC (p = 0.02), associated with proteins rich in leucine, in response to pathogens in plants with CLas-S are expressed up to 12 MDI. While in CLas-A (p = 0.01) the expression was at 6 MDI, mainly of WRKY70 activator of other defense genes dependent on salicylic acid. The highest regulation of CDR13 (p = 0.06), putatively related to resistance to constitutive diseases, was in CTV. The regulation of PP2-B13, related to the phloem protein, for CLas-S was low (p = 0.28) contrary to CTV (p = 0.06).