Caracterización molecular de Laelia halbingeriana y su propagación in vitro

Abstract

Laelia halbingeriana pertenece a la familia Orchidaceae y debido a su descubrimiento relativamente reciente, no se ha caracterizado morfológica, cromosómica ni molecularmente. Con la finalidad de conocer la diversidad de esta especie y su posible relación con L. anceps, L. superbiens y L. autumnalis, la caracterización molecular mediante el análisis de RAPDs se utilizaron 16 iniciadores, cuatro iniciadores mostraron productos de amplificación aceptable. Se observó 60.97 % de polimorfismo que denota gran variabilidad entre las especies de Laelia. Por otra parte se observó que el número cromosómico más común es de 2n=36. Además, en un tercer estudio se desarrolló una metodología para la propagación in vitro de L. halbingeriana se utilizó el medio de MS (1962) suplementado con 6-benciladenina (BA) (0.0, 2.22 y 4.43 µM•litro-1) y 3-ácido naftalenacético (ANA) (0.0, 2.60, 5.20 y 10.40 µM•litro-1). Con estos medios fueron cultivadas plántulas de 2.5 cm con tres concentraciones de sacarosa (58.43, 87.64 y 116.85 mM•litro-1) y cinco de sales minerales del medio MS (50, 75, 100, 125 y 150 %). Para el enraizamiento, las plántulas fueron cultivadas en medio MS suplementado con cinco concentraciones de ANA (0.0, 2.60, 7.80, 10.40 y 13.00 µM•litro-1) y cinco de ácido 3-indolbutirico (AIB) (0.0, 4.92, 7.38, 9.84 y 12.30 µM•litro-1). Se utilizó el diseño experimental completamente al azar con arreglo factorial y diez repeticiones. En la etapa de multiplicación, el BA (2.22 µM•litro-1) incrementó el número promedio de hojas por planta (3.93), mientras que la mayor longitud (1.11 cm) se logró al adicionar ANA (5.20 µM•litro-1). La concentración de azúcar y las sales minerales no influyeron en la organogénesis in vitro de L. halbingeriana. En el enraizamiento, el mayor número de raíces por planta (2.62) se obtuvo reduciendo las sales minerales a 75 %, la adición de 7.80 µM•litro-1 de ANA incrementó el número de raíces (2.86). Las plántulas provenientes del cultivo de tejidos fueron cultivadas en charolas de plástico en condiciones de invernadero. Los sustratos utilizados fueron la corteza de encino y el peat moss, con y sin enraizador, se comparó el crecimiento y desarrollo de las plántulas in vitro e in vivo. Después de 8 meses del inicio de los experimentos, las variables evaluadas fueron: altura de planta, número y longitud de hojas, número y longitud de raíces. La reflectancia de las hojas estuvo influenciada por el contenido de sales minerales así como las concentraciones de ANA al medio de cultivo, además se cuantificó el contenido de clorofila mediante el método de N-N-Dimetilformamida y las mediciones SPAD de hojas de diferentes tonalidades de verde. El diseño experimental fue completamente al azar con cuatro repeticiones. Los datos fueron sometidos a análisis de varianza complementados con la prueba de Tukey al 5 %. Los resultados mostraron que la corteza de encino, fue el sustrato que favoreció el enraizamiento y supervivencia de las plántulas en la etapa de aclimatación, además se encontró una relación positiva entre contenido de clorofila y las lecturas SPAD, por otra parte se observó que la supervivencia de las plántulas a las condiciones ex vitro estuvo influenciada por la intensidad de color de los explantes. _______________ ABSTRACT: Laelia halbingeriana belongs to the family Orchidaceae and because of its relatively new discovery, it has not been characterized morphologically, chromosomically nor molecularly. With the aim of knowing the diversity of this species and its posible relationship with L. anceps, L. superbiens and L. autumnalis, for the molecular characterization through the analysis of RAPDs, 16 primers were used. Four of them showed aceptable amplification products. It was observed 60.97 % polimorphism, which denotes a great variability among the species of Laelia. On the other hand, it was observed that the most common chromosomic number is 2n=36. Moreover, in a third study, a methodology was developed for the in vitro propagation of L. halbingeriana in which the médium MS (1962) was used, supplemented with 6-benciladenine (BA) (0.0, 2.22 and 4.43 µM•liter-1) and 3-naftalenacetic acid (ANA) (0.0, 2.60, 5.20 and 10.40 µM•liter-1). With these media, seedlings of 2.5 cm were cultured with three sacarose concentrations (58.43, 87.64 and 116.85 mM•liter-1) and five of mineral salts of the médium MS (50, 75, 100, 125 and 150 %). Fort he rooting, the seedlings were cultured in the médium MS supplemented with five concentrations of ANA (0.0, 2.60, 7.80, 10.40 and 13.00 µM•liter-1) and five of 3-indolbutiric acid (AIB) (0.0, 4.92, 7.38, 9.84 and 12.30 µM•liter-1). A completely random experimental design was used with factorial array and ten repetitions. At the stage of multiplication, the BA (2.22 µM•liter-1) increased the average number of leaves per plant (3.93), while the largest length (1.11 cm) was achieved by adding ANA (5.20 µM•liter-1). Sugar and mineral salts concentration did not influence in the in vitro organogénesis of L. halbingeriana. During rooting, the largest number of roots per plant (2.62) was obtained by reducing the mineral salts to 75 %. Addition of 7.80 µM•liter-1 of ANA increased the number of roots (2.86). Seedlings coming from the tissue culture were grown in plastic trays in greenhouse conditions. Sustrates used were oak crust and peat moss, with and without rooter. The growth and development of seedlings in vitro and in vivo was compared. After 8 months of the starting of the experiment, the evaluated variables were: Height of the plant, number and length of leaves and number and length of roots. Reflectance of leaves was influenced by the contents of mineral salts as well as the concentration of ANA to the culture médium. Besides, the chlorophile contents was quantified through the method N-N-Dimetilformamide and the SPAD readings of leaves with different shades of Green. The experimental design was completely random with four repetitons. Data was subject to a variance analysis complemented by the Tukey test at 5%. Results showed that the oak crust was the sustrate that favored the rooting and survival of seedlings at the aclimatization stage. Moreover, a positive relationship was found between the chlorophile contents and the SPAD readings. On the other hand, it was observed that the survival of seedlings to the ex vitro conditions was influenced by the intensity of the color of the explants.