Determinación bioquímica de la actividad enzimática de aminopeptidasa (tcAPE) y amplificación de fragmentos de ADNc de posibles genes TcAPE de Theobroma cacao L

Abstract

En el presente trabajo, se propuso realizar una determinación bioquímica de la actividad enzimática de aminopeptidasa (tcAPE) durante los procesos de germinación y fermentación de la semilla de T. cacao L., así como amplificar los extremos 3’ de fragmentos de cDNA de los posibles genes codificantes. El trabajo inició con la determinación de la actividad enzimática de tcAPE. Los resultados indicaron que la actividad enzimática de tcAPE, está presente durante el proceso de germinación de la semilla de T. cacao L., sin embargo, la síntesis de esta enzima se eleva durante la fase de crecimiento, misma que corresponde a la última etapa del proceso de germinación de la semilla de cacao criollo del genotipo almendra blanca. La actividad de tcAPE también se detectó durante el proceso de fermentación, observándose una disminución progresiva a partir del día 2 hasta el día 6, con una actividad residual del 21.88%. Por otro lado, también se pudo concluir que la(s) enzima(s) tcAPE ensayada, pudiera estar localizada en la membrana o pared celular, dado que la actividad enzimática, solo pudo ser detectada agregando Triton X-100 al regulador de trabajo. La segunda etapa del trabajo inició con la extracción del RNA total, obtenido a partir de muestras de radícula y cotiledón de semillas de cacao, germinadas en condiciones de esterilidad. El cDNA fue amplificado con el Sistema RACE 3’ (Rápida Amplificación de Extremos 3’ del cDNA; 3´ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends), los oligonucleótidos iniciadores AUAP (proporcionado por el fabricante) y seis GSP’s. Los GSP’s fueron diseñados a partir de alineamientos múltiples de genes APE descritos en plantas y depositados en la base de datos del NCBI. Se lograron amplificar fragmentos de cDNA empleando cuatro iniciadores GSP’s; sin embargo, debido a problemas técnicos, los fragmentos no pudieron ser enviados a secuenciar. Por lo anterior, no fue posible realizar un análisis bioinformáticos que nos ayudara a predecir la función de los genes amplificados._______This paper proposes to make a biochemistry determination of the enzyme activity of aminopeptidase (tcAPE) during the processes of fermentation and germination of the seeds of T. cacao L., and to amplify the ends 3 'cDNA fragments of genes coding potential. The work began with the determination of enzyme activity of tcAPE. The results indicated that the enzymatic activity of tcAPE, is present during the process of seed germination of T. cacao L., however, the synthesis of this enzyme rises during the growth phase, which corresponds to the last stage of the process of germination of the seeds of the creole cacao genotype almond white. The activity also detected tcAPE during the fermentation process, showing a progressive decline from day 2 until day 6, with a residual activity of 21.88%. On the other hand, it could also be concluded that the (s) enzyme (s) tcAPE tested, could be located in the membrane or cell wall, because the enzyme activity, could only be detected by adding Triton X-100 to the regulator of work. The second phase of work began with the extraction of total RNA, obtained from samples of radicle and cotyledon of cacao beans, sprouted in a sterile condition. The cDNA was amplified with the System RACE 3 '(Rapid Amplification of 3' end of the cDNA; 3 'RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends), the oligonucleotide primers AUAP (provided by the manufacturer) and six GSP's. The GSP's were designed from alignments of multiple genes in plants and described APE deposited in the NCBI database. It was possible to amplify fragments of cDNA using four starters GSP's, but due to technical problems, the fragments could not be sent to sequencing. Therefore, it was not possible to make a bioinformatics analysis that will help us predict the function of genes amplified.